基于网络药理学卷柏活血通经的作用机制分析

刘 畅，聂承冬，邓 斌，李文娣，刘博男，侯冰乔，王淇漩，李文兰*，温 静*

(1. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药物工程技术研究中心，哈尔滨 150076)

卷柏为卷柏科卷柏属植物Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring，主要功效为活血通经[1].卷柏在《神农本草经》中首次记载为为活血化瘀类药物[2].研究发现卷柏具有抗凝血或抑制血小板聚集的作用.在中医范畴中，血栓即为血瘀证[3].卷柏被用作促进血液循环的传统中药，具有较好的抗血栓活性，在中药临床上常用于治疗血栓相关疾病，例如脑血、心肌缺血及糖尿病并发症等[4].目前卷柏活血通经的功效作用机制尚不明确，基于此，本文通过网络药理学的方法，分析卷柏活血通经的作用机制，为卷柏的现代药理学提供参考.

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

本研究所涉及的数据库有PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、String (https://string-db.org/cgi/input.pl)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Cancer HSP(http://tcmspw.com/CancerHSP.php)、OMIM(http://www.omim.org/)、Uniprot(https://www.uniprot.org)、swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和DAVID6.7 ( https://david. ncifcrf. gov/)；Cytoscape 3.7.2.

1.2 卷柏活性成分的筛选

通过TCMSP数据库筛选活性成分，条件为“OB>30%和DL ≥0.18”.同时通过文献检索，收集补充卷柏活性成分进，最终确定卷柏的主要活性成分.

1.3 卷柏活性成分活血通经靶点的筛选

利用TCMSP，CancerHSP和PubChem数据库获取卷柏中活性成分的作用靶点.4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，Farrerol，FastigilinB这些成分通过SwissTargetPrediction进行预测，再通过Uniprot进行基因信息校正，获得预测的卷柏成分靶点.卷柏在活血方面研究主要用痛经，经闭，抗血栓，抗凝血故以“Dysmenorrhea，Amenorrhea，Anti-thrombotic，Anticoagulant”为关键词，在GAD和OMIM数据库搜索整理基因，从而确定卷柏痛经、经闭、抗血栓、抗凝血的作用靶点.

1.4 活性成分-作用靶点网络的构建

将卷柏的活血通经作用靶点和活性成分导入Cytoscape中，并构建网络图，筛选出核心网络，从而得到卷柏活血通经的主要活性成分.

1.5 蛋白相互作用(PPI)网络构建与分析

将卷柏痛经、经闭、抗血栓、抗凝血的靶点基因导入string平台中，获取数据，构建卷柏活血通经相关疾病的蛋白-蛋白相互作用网络(PPI).

1.6 核心靶点富集分析与可视化

通过DAVID6.7，对卷柏的靶点进行GO与KEGG富集分析.

2 实验结果

2.1 卷柏活性成分的筛选

以OB>30%和DL ≥0.18为指标，共得到26个卷柏的活性化合物，见表1～3.

表1 卷柏中的活性成分(TCMSP)

表2 通过Swiss Target Prediction预测生物利用度获得的活性成分

表3 通过文献补充的卷柏活性成分

2.2 收集卷柏活性成分作用靶点

通过TCMSP，Pubmed 数据库和SwissTargetPrediction预测确认了卷柏各个活性成分抗凝血、抗血栓、痛经、经闭相关靶点，依据数据库挖掘得到凝血、血栓、痛经、经闭相关基因，去重后得到1243个，将凝血、血栓、痛经、经闭靶点与药物靶点映射，得到靶点342个，确定为卷柏抗凝血、血栓、痛经、经闭的靶点基因.

2.3 活性成分-作用靶点网络构建

卷柏活血通经靶点基于以343个凝血、血栓、痛经、经闭靶点基因，建立卷柏化合物-活血通经靶点网络图(如图1所示)，通过网络拓扑学结构数据得到中位度数为10，在度值> 10的化合物中，有4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，Farrerol，FastigilinB，度值分别为28、28、27、26、26、26、25、25、22、19、14、13这些可能是卷柏中主要抗凝血、血栓、痛经、经闭的物质基础.

图1 卷柏成分-靶点相互作用网络

2.4 蛋白相互作用(PPI)网络构建与分析

卷柏活血通经蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)中节点平均度数是8，以大于2倍Degree数值即16，筛选出核心靶点，得到9个核心靶点，具体见表4，它们与其他蛋白相互作用更强些，在该网络中发挥了关键作用.

表4 核心靶点及拓扑参数

2.5 核心靶点富集分析与可视化

采用DAVID数据库对卷柏活性成分抗凝血、血栓、痛经、经闭靶点进行GO和KEGG分析.GO分析结果中，细胞生物过程富集的基因数较多，说明卷柏主要通过调节以上生物过程发挥活血通经作用.根据Count排序，筛选出BP Bioprogress13个，CC cell components11个，MF Molicular Function10个，结果如图2(根据Count排序，取前十)所示，Pathway10个，结果如表3所示.KEGG分析中有10条信号通路，如Proteoglycans in cancer、Estrogen signaling pathway、Bladder cancer等，对10条通路进行可视化处理，结果如图3所示.

图2 卷柏活血通经靶点生物过程(GO)富集分析结果

表5 卷柏活血通经靶点的KEGG通路富集分析结果

图3 卷柏主要靶点富集通路气泡图

表4 KEGG通路富集分析

3 讨 论

血栓性疾病是由血栓过度形成导致血管部分或完全堵塞引起的相关疾病.血栓分布在人体不同部位引起的脑血管、心血管及外周性血管疾病的患病率及死亡率处于上升趋势，因此治疗血栓疾病的关键是要预防血栓的形成[4-10].在中医理论中，痛经的主要原因是六大外感邪入侵造成的肝气郁结，气滞兼阻滞血流，进一步形成血瘀和肿块，经期疼痛是由于血液停滞和滞留[11-16].活血化瘀药主治血瘀证和血栓相关疾病等，而卷柏在中国被广泛用作改善血液循环的药物[17].同时《神农本草经》又将卷柏列为活血化瘀药.研究发现，卷柏可以延长小鼠的凝血时间，具有抗凝血作用[18].但卷柏活血通经的药效物质基础较薄弱，本文基于网络药理学分析预测卷柏中活血通经分子作用机制.

在卷柏活性成分及疾病靶点网络中分析表明AKT1、ALB、VEGFA、EGFR、PTGS2、MMP9、KDR、ESR1和MMP2等可能是卷柏的主要靶点，其中AKT1在靶点网络PPI中度值相对较大，AKT1是促炎因子，在高血压导致的心肌纤维化中，可能通过促进炎症反应，进而调节成纤维细胞的转分化为发挥作用[19].通路富集分析结果表明卷柏活血通经靶点主要集中在Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、Estrogen signaling pathway、Bladder cancer、VEGFsignaling pathway等通路.抗凝和促凝是两个重要的生理过程，促凝和抗凝过程之间的平衡发生紊乱，最终可能导致严重出血或血栓形成，许多源自中药的天然产物在治疗出血或血栓形成方面显示出其治疗潜力，中药卷柏具有良好的抗凝血作用，可消除血瘀，如心肌缺血和糖尿病并发症，同时有文献报道卷柏中的穗花杉双黄酮能通过抑制血小板聚集起到活血的作用[4,20]，但卷柏炭则具有止血的作用[18]，尽管有报道称卷柏炒后某些黄酮类化合物减少，但没有研究揭示具体的化合物，现代综合性药理实验很少进行[20].

综上，本研究采用网络药理学的方法预测及分析卷柏活血通经活性成分的可能作用靶点及通路，确认4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，Farrerol，FastigilinB可能是卷柏活血通经的主要活性成分，但其作用机制还有待于进一步研究.