基于光声成像的生物组织微结构定征研究进展∗

张涛 陶超 刘晓峻

(南京大学声学研究所 近代声学教育部重点实验室 南京 210093)

0 引言

生物活体组织的定征和分类不仅对于生命科学基础研究具有重要科学价值，而且对于药学、临床医学等领域也有着重要应用前景。因此，组织定征和分类得到生物医学成像领域的持续关注[1−3]。

利用光学成像方法是最常用的生物医学成像技术，并被广泛地应用于组织病理切片检查等领域。基于每种原子和分子均具有独特的光谱特性，光学成像可以特异性地检测生物组织生化成分，从而灵敏地反映生物组织的功能信息。因此，光学成像具有对比度高、区分度好、功能信息丰富的优点。为此，人们研发出多种光学成像系统，包括共聚焦激光扫描显微镜[4]、双光子显微镜[5]、光学相干断层成像[6]等，这些光学成像技术在生物医学上取得诸多的成功应用。但是，由于生物组织是光的强散射媒质，光波在组织中传播的平均自由程仅1 mm[7]。当超过这个深度后，强烈的随机散射会干扰光束的有效聚焦。所以，在强散射组织中，光学方法成像深度受限，通常只能获得深度1 mm以内高质量组织图像，当成像深度大于1 mm时，其空间分辨率严重下降，大约仅有成像深度的1/3[8]。

声学成像由于其生物安全性高、成像深度深、经济易用等特点，而成为临床医学应用最广泛的成像技术之一。声学成像以声波为信息载体，声波是机械波，相较于光波，其波长更长。因此生物组织对声波的散射强度远弱于其对光波的散射强度，组织中的声散射比光散射要弱2～3个数量级。这使得在深层组织中，声学成像的空间分辨率可以达到成像深度的1/200，远远优于光学成像[7]。传统声学成像的成像参数来自组织的力学参数，比如B超利用组织声阻抗差异用超声回波进行图像重构。但是，软组织中各种成分的声阻抗差异并不显著，所以声学成像的对比度不高，分辨组织的功能特性不如光学成像那样敏感。

光声成像是基于光声效应的一种新型复合无创生物医学成像技术[7]。当生物组织被脉冲或者调制激光照射后，组织中的光吸收体吸收激光能量而产生瞬时热膨胀，进而向周围媒质辐射超声波，这就是光声效应[9−10]。光声效应激发出来的超声波信号又叫光声信号。通过接收组织激发出来的光声信号，可以反演组织中的光吸收系数空间分布，并构建图像。可以这样说，光声成像过程以超声波为载体，获取组织深处的光学吸收信息。因此，光声成像兼具了声学成像在深层组织中成像深度深、空间分辨率高的优点，又具有光学成像对比度高、功能信息丰富的优点[7,11]。而且，由于光声成像是非电离辐射的成像技术，故相较于X射线成像和CT成像等这种电离辐射成像手段，光声成像生物组织安全性好。因为这些优点，光声成像得到了极大的发展并且已经融入了各种生物医学应用中，比如肿瘤检测[12−13]、微血管成像[14]、骨关节炎评估[15]、毒品安检[16]等。

本文简要地解释了光声成像的基本原理，以及光声显微镜成像(Photoacoustic microscopy,PAM)和光声计算机断层成像(Photoacoustic computed tomography,PACT)这两种典型的光声成像实现方案，最后综述了从光声信号中提取组织微结构特征参数的研究，并讨论它们在组织分类中的潜在应用。

1 光声成像原理与技术实现

1.1 光声成像基本原理

光声成像系统利用脉冲激光或调制激光照射生物组织，组织中的光吸收体吸收激光能量导致温度升高，如果脉冲激光宽度小于热激发弛豫时间，光吸收体在极短的时间内吸收大量激光能量而产生局部压力，然后激光照射消失，热胀冷缩使得这种局部压力释放，并向周围媒质辐射超声波，这就是所谓的光声效应，光声效应产生的超声波又被称为光声波或光声信号。对于任一时刻t、空间任一位置r处，光声波的压强p(r,t)的时空分布由公式(1)描述[17]：

其中，声源分布p0(r0)=Γ(r0)A(r0)，c是组织中的声速，τ(t)是激光脉冲的脉宽，Γ(r)和A(r)是成像区域的Grüneisen系数和光吸收系数的空间分布函数。组织内部激发出来的光声信号经传播后，会被布置在组织周围的超声换能器或者超声换能器阵列接收到，根据接收到的光声信号p(r,t)，求解光声传播的逆问题，从而反演光声声源的空间分布p0(r0)[18−21]，并且据此获得光声图像。因为声源分布p0(r0)与成像区域的光吸收系数空间分布A(r0)成正比，所以光声图像的对比度与组织中的光吸收系数分布相关。正因为如此，光声成像与光学成像一样，具有丰富的光学对比度，能够无标记地获取组织的生化和功能信息。另一方面，光声成像过程中，光吸收信息是以超声波为载体传播并被检测到的，由于超声波在生物组织中低散射、低衰减、高穿透的特性，光声成像又像超声成像一样能够获得组织深处高分辨率的图像。

根据光声信号的激发、接收方式的不同，光声成像技术可以大致分成光声显微镜成像和光声计算机断层成像两类实现方案。根据需求的不同，它们可用于达到不同的空间分辨率和成像深度。

1.2 光声显微镜

光声显微镜通常将脉冲激光聚焦在成像样品上激发光声信号，并利用点聚焦超声换能器接收光声信号，为了获得最优的探测灵敏度和成像分辨率，通常需要使得声焦点与光焦点共聚焦[22−24]，见图1(a)。根据每一点接收到的光声信号强弱可以反演该点光吸收系数大小；根据接收到的光声信号延时，可以计算光吸收体在超声换能器声轴上的位置，从而获得该点的一维图像。进一步通过逐点扫描样本，不需要复杂的成像算法，就可以得到样品二维或三维的光声图像。

图1 光声显微镜成像系统示意图Fig.1 Schematic diagram of photoacoustic imaging systems

当成像深度小于生物组织的光学平均自由程时(约1 mm)，由于激光能够在此深度范围内有效聚焦，光焦点大小可以达到光学衍射极限，光学聚焦性能优于声学聚焦性能，光学焦点小于声学焦点，此时光声显微镜系统的侧向分辨率(也就是垂直于声轴和光轴的面)主要取决于光学焦点的大小，可以达到0.51λopt/NA，NA是光学透镜的数值孔径，λopt是激光的波长。因为分辨率是激光焦点决定的，这种光声显微镜系统又被称为光学分辨率光声显微镜(Optic-resolution PAM,OR-PAM)。而围绕光学焦点与声学焦点共聚焦的问题，很多新颖的解决方案被提了出来，例如换能器与光源相对放置在样品两侧的检测方式[25−27]；亦或使用允许激光从中间通过的环形换能器进行检测[28]；采用夹胶透明棱镜折射声路的探测方案[23,29]；此外，通过增加声反射板的反射式光学分辨率光声显微镜系统，见图1(b)，可以在不要求定制改动光学、声学硬件的情况下，大幅提高声学探测灵敏度，进而提高成像质量[30]。虽然光学分辨率光声显微镜的成像深度仅有1 mm左右，但是它最高可以提供纳米级的侧向分辨率[31]。

当成像深度大于1 mm、光焦点深度超过生物组织的光学平均自由程时，由于组织对激光强烈散射作用，光学聚焦质量变差，声学聚焦开始优于光学聚焦，声焦点大小小于光焦点大小。这种情况下，光声显微镜的侧向分辨率取决于声焦点尺寸0.71·vs/(f0·NA)，其中vs、f0、NA分别为组织中声速、光声信号中心频率、声学数值孔径[7]。由于这种类型的光声显微镜其侧向分辨率取决于声焦点大小，因此它又被称为声学分辨率光声显微镜(Acoustic-resolution PAM,AR-PAM)[24]。声学分辨率光声显微镜的成像深度可达几毫米至几十毫米，成像分辨率可达几十微米到一两百微米。此外，通过综合运用超声-光声多模成像技术、合成孔径成像与虚拟点探测器等一系列新技术[32−33]，可以进一步提高声学分辨率光声显微镜的成像质量。如图1(c)所示，采用自校准声速虚拟点探测器的方法，可以显著提高声学分辨率光声显微镜非聚焦区域的图像质量。

光声显微镜需要通过逐点扫描样品，获得光声图像，这一过程限制了光声显微镜在较大成像区域的成像时间，而光声计算机断层成像则可以提供更深的成像深度、更大的成像区域、更快的成像速度。

1.3 光声计算机断层成像

光声计算机断层成像采用非聚焦光源照射整个成像区域，然后利用包围成像区域放置的非聚焦或线聚焦超声换能器阵列接收来自样品的光声信号(见图2)，并通过求解光声传播的逆问题重构光声图像。光声计算机断层成像的图像构建依赖计算机计算和图像重构算法，常见的重构算法有反相投影算法[21,34]、延时求和法[35]，目前广泛采用的通用反相投影重构公式由Xu等[21]提出：

其中，p0(r)为位置r处的初始声压，Ω0是测量面S0关于重构点的立体角，ns0是测量面关于源点的单位法向量。

此外，为了克服组织非均匀声学特性对成像效果的不良影响，人们还提出了利用虚拟声源实现格林函数重构[18]，将随机矩阵理论的滤波算法与时间反转法相结合[19]，以及全矩阵相干滤波器[20]等多种成像算法，提升光声计算机断层成像的成像效果。

光声计算机断层成像的成像深度可达6～7 cm，其成像轴向分辨率取决于超声换能器的带宽∆f，为0.88·vs/∆f[7]，vs是组织中的声速。因此，光声计算机断层成像的空间分辨率和穿透深度可以通过选择具有合适频率和带宽的超声换能器进行调节。

总而言之，光学分辨率的光声显微镜、声学分辨率的光声显微镜、光声计算机断层成像在成像深度和成像分辨率上提供了多尺度的生物医学成像技术。

图2 光声计算机断层成像系统示意图[36]Fig.2 Schematic diagram of photoacoustic computed tomography[36]

2 光声信号中的组织微结构信息

基于分子特定的选择性光吸收特性，光声成像能够灵敏地揭示组织的分子构成的差异。利用不同波长或者复合波长的脉冲激光激发光声信号，光声成像成功无标记地获取了细胞核、脂肪和蛋白质、血氧饱和度、血红蛋白浓度、血管的高对比度图像[13,28,30−32,37−39](见图3)。

图3 生物组织中的光声成像Fig.3 Photoacoustic imaging in vivo

然而，除了生化组分和分子信息外，生物组织的微结构特性，例如微结构尺寸、微结构数量密度、微结构弹性等，也是区分不同组织类型的有效标识。并且，组织的生理功能与其微结构特性密切相关，因此对组织微结构信息的评估有着极高的生物医学应用价值。光学分辨率的光声显微镜虽然具有足够高分辨率揭示组织的微观形态，但是它的成像深度仅有1 mm，并不适合对深层组织微结构特性进行原位检查。声学分辨率的光声显微镜和光声计算机断层成像能够获得深层组织的图像，并且具有声学分辨率精度。它们的分辨率主要取决于接收到的光声信号的频率及带宽，因此，必须采集高频、宽带的光声信号，以获得足够的分辨率来呈现组织的精细结构。但由于超声波在生物组织中传播衰减随着频率的升高而增加，高频超声波在组织中的强衰减会严重制约这两种成像技术的成像深度。例如，为了获得45µm的成像分辨率，接收的光声信号中心频率需要高达50 MHz，在如此高的频率下，声波仅能在组织中传播约3 mm[40]。总而言之，评估深层组织的微观结构信息依然是一项具有挑战性的课题。

近期，一系列研究揭示光声的原始射频信号含有与生物组织微观特性相关的丰富复合信息，通过对光声射频信号的分析，从而提取与生物组织的微结构相关的特性参量，为组织分类提供的新的视野和技术可能性。

2.1 微结构尺寸

组织的微观结构的特征尺寸是组织的一项基本属性，它指的是构成组织微小单元的大小，例如细胞团或色素团的大小、微血管的直径等[41−42]。因为实际组织的微结构的空间分布具有随机性，其光声信号总是呈现出类似噪声信号的随机性。所以，对信号随机波形的分析难以揭示组织的微观结构特征尺度。然而，通过对光声信号功率谱的研究，可以有效地提取与组织微观结构尺度相关的特征参量。光声信号功率谱分析是提取组织微结构特性的一个有效的工具[43−44]。人们利用蒙特卡洛模拟和实验测量，发现光声信号的功率谱性质和红细胞聚集水平相关[42]，还和单个红细胞的形态学相关[45]。另外，在离体实验中，人们也发现癌变组织与正常组织的光声功率谱有着显著的差异[46]。

Yang等[47]理论解析了微结构尺寸和归一化光声功率谱之间的关系：

公式(3)成功预测了随机微观结构光声信号功率谱的几个基本性质：(1)随机组织的光声信号有确定性的功率谱特性，微结构特征尺寸越大，其产生的光声信号功率谱带宽更窄，反之则功率谱带宽更宽。(2)归一化光声信号功率谱的斜率与系统增益、光源强度等测量设备参数无关，而仅与组织微结构特性有关，因此，光声频谱参数可以提供排除系统响应影响的定量结果[41]。(3)光声功率谱的差异可以通过对功率谱进行最佳线性拟合得到频谱斜率参数进行量化。微结构尺寸越大，功率谱斜率越小。所以光声功率谱斜率可以量化组织微结构的特征尺寸。一个更有趣的发现是，上述性质在光声信号的低频段依然是成立的，因此，光声功率谱斜率作为成像参数，可以区分声学亚波长尺寸的微结构，从而有望利用低频窄带光声信号对深层组织的随机微观结构进行定量分析。理论分析的结论很快就被含有微球仿体实验验证了[47−50]。基于此，采用光声功率谱斜率便能有效地根据不同的微结构尺寸，对深层组织进行分类[51]。如图4(c)所示，对健康牙齿牙冠以光声信号的频谱斜率为对比度参数成像时，可以看到牙齿有清晰的两层结构，其中牙本质对应频谱低斜率区域，牙釉质对应频谱高斜率区域，实现了对牙本质与牙釉质的有效区分。接着，这个理论还被成功地拓展到由非均匀尺寸的微结构中或者微血管网络中[42,52]。声学分辨率光声显微镜同样能对深层组织进行分类，其成像对比度源自组织的光吸收特性，而其侧向分辨率则取决于声焦点的大小。当微结构尺寸小于声焦点时，就需要提高成像系统的中心频率，而高频声波在组织中的强散射特性，又反过来制约了成像深度。也就是说，对于声学亚波长光吸收体，声学分辨率光声显微镜无法对微结构尺寸进行区分。而基于频谱参数，可以定量地表征微结构的尺寸，并以微结构尺寸为对比度参数进行成像，进而实现对深层组织中声学亚波长尺寸微结构的区分[42]。如图5所示，对于中心频率为4.39 MHz的传统光声显微镜，无法区分厘米量级深度下60µm以及150µm尺度的微血管网络，而以功率谱斜率为成像参数的成像结果则可以进行区分。

图4 对一颗健康牙齿牙冠的光声成像结果[51]Fig.4 Photoacoustic imaging of the crown of a healthy tooth[51]

图5 对声学亚波长尺寸微血管仿体成像结果[42]Fig.5 Photoacoustic imaging of acoustic sub-wavelength sized microvascular phantom[42]

光声信号的功率谱性质为解决一系列常规成像手段面临的实际难题提供了新的解决方案，这些问题有设备依赖性、微结构尺寸的量化和随机微结构的可重复性实验，以及声学亚波长尺寸结构的定量评估与分类。这些优点说明了，功率谱参数可以克服成像分辨率和成像深度之间的冲突，并且为探测深层组织的随机微结构尺寸提供了有价值的工具。所以，光声信号的功率谱分析被发现有一系列的潜在应用，包括血管网络增生、早期牙体病变检测、肝脏组织分化、肿瘤检测、骨骼检查等[42,46,51,53−55]。

2.2 微结构数量密度

组织微结构数量密度是组织的另一个重要属性。微结构数量密度是指单位体积内特定的微小单元的数量，例如微血栓、细胞团、血管数量密度等[26,56]。研究表明统计学方法也是评估组织微结构特性的一种有效手段。超声检测技术的研究表明超声回波信号的统计参数可以反映肝脏纤维化程度[57]、骨质疏松程度[58]、区分良性或恶性肿瘤[59]、评估乳房肿块等[60]。光声检测的研究也表明，光声信号的包络统计性质在检测组织微结构方面也极具价值。随机分布的红细胞光声信号包络统计直方图可以很好地用瑞利分布拟合[41]。根据统计参数或者包络统计直方图的变化可以区分不同组织[61]或者检测出混合有黑色素瘤细胞的红细胞[62]。最近，Nakagami统计被用来分析光声信号包络R(t)的统计特性，并对随机微结构的数量密度进行定量化研究[63]。Nakagami分布的概率密度函数为[64]

其中，信号包络R可以用希尔伯特变换计算，Γ和U是Gamma函数和单位阶跃函数。参数m、Ω分别代表Nakagami形状参数和尺度因子，决定了概率密度函数f(R)的形状和范围。尺度因子Ω不仅与微结构的内在特征有关，还与测量系统特性有关，例如激光强度和系统增益等。然而，形状参数m仅与微结构的分布形状有关。参数m和Ω可以用最小二乘法拟合来确定，或者可以用m=[E(R2)]2/E[R2−E(R2)]2和Ω=E(R2)来确定，E代表数学期望值。理论计算仿真与实验测量表明，Nakagami形状参数m是一个与测量系统无关的统计参量，它会随着微结构数量密度的增加而单调地增加，因此可定量地衡量微结构的数量密度[63]。结合了Nakagami形状参数和功率谱斜率参数的光声计算机断层成像系统，成功地区分了具有不同微结构特性的实验仿体[63]。如图6(a)所示，依据仿体微结构尺寸和数量密度的差异，样品分为S1、S2、S3三个等大小的子区域。图6(d)显示以光声信号功率谱斜率为参数成像成功地区分了不同尺寸的微结构，而图6(e)显示以Nakagami形状参数m为参数成像成功地区分了不同浓度的微结构。

图6 混合仿体的多成像参数光声计算机断层成像结果[63]Fig.6 Photoacoustic computed tomography imaging of the mixture phantom with different imaging parameters[63]

2.3 微结构弹性

组织中微结构的弹性是一个组织特性的重要标记参数，它可以用来区分不同组织，识别多种涉及组织病变的疾病，例如肝硬化[65]、动脉粥样硬化[66]和前列腺癌[67]等。已有很多技术方法用来评估材料的弹性特性[68−71]，然而它们各有其优缺点。超声弹性成像是一种无侵入式的并且被广泛用于临床检测组织弹性的手段，但是受限于超声的波长，这种手段仅适用于较大尺度组织。超声共振法是另一个常用的弹性检测的技术，但它往往要利用接触式换能器激发待测物的机械共振，并利用接触式换能器或光学技术检测物体的振动信息，其中的光学技术虽然是非接触式的，比如激光多普勒干涉仪，但如果待测目标浸在浑浊的媒介中(生物组织普遍符合这一情况)，光的强散射就会限制它的应用。此外，这种办法需要把样品切割成特定的形状，所以超声共振法并不适合用于非均匀的生物活体组织。原子力显微镜可以提供高精度的局部弹性检测，但是，它仅局限于表面或者亚表面的检测。

最近，通过测量弹性光吸收物体产生的光声信号，人们发现了光声本征振动现象[72]。当弹性光吸收体被脉冲激光照射时，弹性体会吸收光能并由于热弹效应释放出超声波。当激光照射撤去后，弹性体由于惯性和弹性会持续振动一段时间并持续向周围组织发出超声波，如图7(a)所示。由于弹性体在此阶段处于自由振动状态，其振动模式和弹性体的本征振动模式相关，而辐射的超声波的频谱则和弹性体的本征振动频率有关，也就是说光声信号里包含了弹性体的本征振动信息。由于本征振动模式和本征频率取决于弹性参数，所以通过分析光声信号的频谱特性，还可以反演微结构的弹性特性。通过利用这个办法对各种材料的弹性参数的成功测量，证明了光声本征谱理论的正确性和应用潜力[72−74]。

图7 对钙钛矿晶体MAPbBr3的光声本征谱分析[74]Fig.7 Photoacoustic spectrum analysis of perovskite MAPbBr3[74]

相比于其他弹性检测方法，光声本征谱法有其独特的优势。首先，它可以一次测得样品的所有弹性参数，无需对样品进行特定方向的切割；第二，这个方法完全是非接触式的，无论是振动的激发还是信号的检测，都无需接触被测样品；第三，不同于激光超声法[75]，这种方法检测的是从振动样品向外辐射的超声信号，而不是直接检测振动样品表面的位移。这些特点使得这种方法适用于稀有的、易碎的和小型的样品，尤其是当样品浸在浑浊的以及不透明的液体媒质中的情形，这给检测生物组织不同区域的弹性差异提供了新的可能。

传统的光声成像技术的对比度来源于组织的光吸收特性，但光声信号的激发、传播过程涉及光学、热学、力学等多种物理效应，因此光声成像具有检测组织多种参数的优势。本文详细讨论了通过检测组织微结构的尺寸、数量密度、弹性，利用多种光声成像技术实现对组织微结构特征的非侵入性检测。其中，微结构的数量密度参数，是从光声信号时域上的包络统计分析获得的；而微结构的尺寸与弹性则是通过对光声信号功率谱的分析得到，其差异在于弹性参数与样品的本征振动信息相关，故在功率谱分析时只对尾波进行处理。同时，弹性是微结构的宏观属性，与微结构的尺寸、数量密度息息相关，例如，乳腺肿瘤区域的血管数量密度异常增大，其弹性较大[13]。可以得到启发，通过对组织进行多维度参数的表征，可以大大丰富组织分类信息，进而提高组织分类的准确度。

3 展望

近二十年来，由于光声成像技术的诸多优点和其巨大的生物医学应用潜力，关于光声技术的研究一直得到各国研究团队的高度重视。本文介绍了光声成像的物理基础，以及光声显微镜和光声计算机断层成像这两种主要的光声成像实现方案，并且讨论了它们在成像深度和成像分辨率上性能的差异。最后介绍了根据光声信号对组织微结构特征评估的研究。

光声信号的光声功率谱斜率反映了组织的微结构特征尺寸；光声信号包络的统计特性包含有微结构的数量密度信息；分析光声信号的光声本征谱可以获得微结构的弹性特性。这些新方法突破了传统的光声成像系统频率和带宽的限制，为研究深层组织的各项微结构性质提供了可能的手段。然而，在实际生物医学应用之前，仍有许多工作需要完成，从而进一步改善这些方法。例如，更多的活体和离体实验来检查真实组织的光声功率谱参数和统计参数，尤其是混合各种微结构的复合组织。这些参数和各种生理状况的关系应该还需被进一步探索。另外，光声本征频谱的应用也有一些制约，比如，弹性的量化评估依赖于一些微弹性体的先验知识，包括形状、密度等，而且对于提取高黏度组织的光声本征谱也是一个重要的技术挑战。

近年来对光声成像技术的积极研究已经阐明了其在生物医学领域有很多的潜在应用价值，可以期待，从光声信号中还可以提取更多的关于组织特性的有价值的信息。受益于光声信号中蕴含着的丰富的生物结构和功能信息，光声成像技术作为一个非电离的、非侵入式的技术，将会提供多模态组织信息，从而有望被广泛地应用于基础研究和临床诊断。