多食材替代亚硝酸盐对腊肉挥发性风味的影响

黄 苓，孙 震，曾小群*，潘道东，何 俊，沈建良

（1 省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室 浙江宁波315211 2 浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室 宁波大学食品与药学学院 浙江宁波315211 3 浙江卓旺农业科技有限公司 浙江湖州313014）

腊肉是我国一种传统自然发酵肉制品，其色泽明艳、风味独特，易加工贮藏而深受大众喜爱。然而，目前中国传统腌腊制品的生产面临许多问题，主要包括：腌制配方不合理，食盐和亚硝酸盐添加量过高[1]；加工工艺落后，设备简陋，生产周期长[2]；保鲜技术单一，完全依赖高盐、低水分的保藏方法，使产品质地干硬，口感偏咸等[3]，其中以亚硝酸盐含量过高尤为突出。虽然亚硝酸盐在肉制品中具有呈色、抑菌、改善风味口感、抗氧化等作用[4]，然而，经常摄入会引起中毒及致癌风险，人体一次摄入0.3～0.5 g 亚硝酸盐即可引起中毒，5 g 便导致死亡[5]。很多研究人员致力于低盐、低硝腊肉加工工艺的改进工作[6-7]，然而，目前的工艺所生产的腊肉与传统腊肉相比风味欠佳。风味是影响肉制品质量的重要因素之一，腊肉的加工不再以贮藏为首要目的，其安全性、独特风味等成为人们的关注点，制备安全、高品质和风味好的零添加亚硝酸盐腊肉为当务之急。

本研究通过添加发酵乳杆菌RC4 （能高效降解亚硝酸盐，以体积分数0.2%的接种量接种于亚硝酸盐含量为150 mg/L MRS 培养基中，37 ℃培养18 h，亚硝酸盐的降解率高达96.49%，其中降解速率最快能达13.88 mg/h[8]）和植物乳杆菌B6（对致病性金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、单核细胞性李斯特菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌均有显著的抑制效果[9]）的复配发酵剂、红曲红和甜菜红组合的复配天然发色剂、Nisin、维生素E 以及各种调味物质，替代亚硝酸盐制得零添加亚硝酸盐腊肉。通过对零添加亚硝酸盐腊肉、只添加食盐腌制的腊肉、添加食盐和亚硝酸盐腌制的腊肉的感官评价、亚硝酸盐含量、总体气味和挥发性风味物质进行分析，得到本试验制得的零添加亚硝酸盐腊肉的风味特征，评价其制备方法，为零添加亚硝酸盐腌腊制品的规模化生产及品质优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳杆菌 （Lactobacillus fermentum）RC4、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）B6，两者都分离自新疆酸马奶，实验室保存；新鲜后腿肉，购于加贝超市；亚硝酸盐快速检测试剂盒，南京建成科技有限公司；其它化学试剂（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Infinite 200 pro 全波长扫描多功能酶标仪，瑞士Tecan 公司；7890B-7000C 气相色谱-三重四级杆质谱联用仪，美国Agilent 公司；PEN 3 型电子鼻，德国Airsense 公司；50 μm PDMS/DVB （聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）型萃取头，美国Supelco 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备 零添加亚硝酸盐腊肉（试验组）制备工艺流程：选取新鲜的后腿肉→处理猪肉（1 寸厚，7 寸长）→腌制液的制备→腌制（4℃，12 h）→风干（10 ℃，12 h）→接种复合菌种发酵（19 ℃，25 h）→烘干（50 ℃，24 h）→喷洒乳酸链球菌素→冷却后真空包装→成品。

腌制液成分：食盐3%、生抽5%、黄酒2%、白砂糖2%、花椒粉1%、大蒜1%、柠檬汁1%、茴香粉0.75%、八角粉0.6%、生姜粉0.6%、桂皮粉0.6%、维生素E 0.03%、0.2 g/kg 的红曲红和24 mg/kg 的甜菜红（所有辅料添加的百分含量均以肉重计）。

对照组1：添加3%的食盐腌制的后腿肉；对照组2：添加3%的食盐和0.01%亚硝酸盐腌制的后腿肉：上述两组腊肉在19 ℃的条件下自然发酵且不经过喷洒抑菌素处理。其余加工过程与试验组相同。

1.3.2 感官评定 感官评价小组由20 人组成，包括教师、研究生、本科生，男女比例1∶1，年龄18～45 周岁，均有1年以上的腌腊肉制品感官评定经验。具体实施方法参照GB/T 22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》[10]。所有的样品从外观、味道、气味、质地和总体可接受性5 个方面进行打分，评分范围0～100，取其平均值绘制感官评价雷达图。

1.3.3 亚硝酸盐含量的测定 亚硝酸盐含量采用南京建成快速检测试剂盒进行测定。

1.3.4 电子鼻检测 参考李迎楠等[11]的方法测定，分别称取5 g 切碎的腊肉样品到样品瓶中，压盖密封，在25 ℃条件下水浴10 min 后用于电子鼻检测。

1.3.5 挥发性风味物质的测定及分析 色谱条件：Vocol 毛细管色谱柱 （柱长60 m，内径0.32 mm，膜厚0.18 μm）；载气He 流速为2.25 mL/min；进样口温度210 ℃，不分流进样模式；采用程序升温，初始温度为35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 上升到40 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min 上升到200℃，保持20 min。

质谱条件：电子电离源；接口温度230 ℃；电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；质量扫描范围设定为40～600 u；采用全扫描模式。

定性分析：质谱数据经计算机检索，与NIST14 标准谱库相匹配，仅报道得分大于80（总分为100）的鉴定结果。

定量分析：各挥发性成分的含量按下式计算[21]（内标物为2-甲基-3-庚酮）。

式中：CX——未知挥发性化合物含量，μg/kg；C0——内标化合物质量浓度，μg/μL；V0——内标化合物进样体积，μL；SX——未知挥发性化合物峰面积，AU·min；S0——添加内标化合物峰面积，AU·min；m——试样质量，kg。

1.3.6 OAV 分析 采用OAV 评价各化合物对腊肉总体风味的贡献；0.1＜OAV＜1，说明该物质对总体风味有修饰作用；OAV＞1，说明该物质可能对总体风味有直接影响；在一定范围内，OAV 越大说明该物质对总体风味贡献越大。OAV 按下式进行计算[12]：

式中：C——物质含量，μg/kg；T——感觉阈值，μg/kg。

1.3.7 数据分析 采用电子鼻自带软件Winmuster 对原始数据进行处理和作图，使用IBM SPSS Statistics 21 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），采用±s 表示，使用Duncan’s Multiple Range Test 进行多组样本间显著性差异分析，差异显著水平设置为P＜0.05。试验结果采用Origin 8.5 作图。所有指标均重复测定5次。

2 结果与讨论

2.1 感官评价

如图1所示，试验组的感官评分显著高于其它组（P＜0.05），其总体可接受度评分高达90.5。与对照组相比，试验组腊肉内外颜色均匀鲜艳，富有食欲，外观接受度最高，显著优于其它组腊肉；对照组1 和对照组2 的外部颜色均偏黄，内部分别泛白和偏粉红，颜色不均一，视觉可接受度不佳；市售组酱油色过重，外部偏褐色，内部呈粉红色。因此3 组腊肉的外观感官评分结果显示：试验组＞对照组2＞对照组1。在口感方面，试验组咸淡适中，咀嚼的过程中夹杂着香辛料所散发的香气，不油不腻，硬软适中；对照组1 和对照组2 口感略低于试验组，咀嚼后味偏咸，其中对照组1 肉香味不浓郁，对照组2 虽肉香味适中，但缺少香辛料所赋予的独特色香气。

2.2 亚硝酸盐含量

如图2所示，试验组、对照组1、对照组2 中的亚硝酸盐含量具有显著差异（P＜0.05），分别为0.64，1.31，22.93 mg/kg。其中，对照组2 的含量最高，这是由于其外源添加了亚硝酸盐所致。亚硝酸盐含量超标是腌腊肉制品中首要的安全性问题，除了食物腌制过程中外源添加的亚硝酸盐外，微生物的胺化和硝化作用也能将肉制品中的含氮物质转化成亚硝酸盐。试验组和对照组1 中也存在亚硝酸盐，但试验组中的亚硝酸盐含量显著低于对照组1（P＜0.05），这与腊肉加工过程中使用复配菌株发酵有关。Esmaeilzadeh 等[13]将植物乳杆菌PTCC 1058，发酵乳杆菌PTTC 1638 及两株菌组成混合发酵剂接种到发酵香肠上，发现香肠中残留亚硝酸盐的质量分数别降低86.6%，76.1%，81.9%。此外，Kilic 等[14]研究表明pH 值与亚硝酸盐残留量呈正相关。在B6 和RC4 发酵产酸的条件下，RC4 能够快速降解亚硝酸盐从而降低腊肉中亚硝酸盐残留量。

2.3 电子鼻测定结果与分析

图3为3 种腊肉的电子鼻主成分分析结果图。第一主成分和第二主成分的贡献率分别为99.41%，0.45%，累计贡献率达到99.86%，接近100%，这说明第一主成分和第二主成分已经解释了几乎全部的变异，可用来分析3 种腊肉制品的总体气味。在由第一主成分和第二主成分组成的平面上，试验组在第一主成分上的贡献明显大于对照组1 和对照组2；而在第二主成分上无明显差异。这说明试验组与对照组1、对照组2 的总体气味差距较大。此外，对照组1 和对照组2 在第一主成分和第二主成分上的贡献均仅有微小差异。说明对照组1 和对照组2 的总体气味较为相似。为进一步探究3 种腊肉气味成分的差别，采用顶空固相微萃取-气质联用技术对3 种腊肉中的挥发性成分进行鉴定。

图1 3 种腊肉感官评价雷达图Fig.1 The sensory evaluation radar chart of three kinds of cured meat

图2 3 种腊肉中亚硝酸盐含量Fig.2 The nitrite content of three kinds of cured meat

图3 3 种腊肉电子鼻主成分结果图Fig.3 Principal component result of electronic nose of three kinds of cured meat

2.4 3 种腊肉中挥发性风味物质分析

采用顶空固相微萃取-气质谱联用技术对3种腊肉中的挥发性风味物质进行鉴定，各组腊肉中挥发性成分的组成和含量如表1所示。3 组腊肉中共鉴定出挥发性成分73 种，包括烃类12 种、酸类5 种、酯类14 种、醛类13 种、酮类10 种、醇类11 种、酚类2 种、醚类2 种、其它类4 种。

试验组中共鉴定出挥发性成分71 种，总含量为2 939.68 μg/kg，其中醚类（982.22 μg/kg）、烃类（623.17 μg/kg）、醛类（456.53 μg/kg）为主要挥发性成分。对照组1 中共鉴定出挥发性成分64 种，总含量为1 636.28 μg/kg，其中酮类（479.50 μg/kg）、醛类（445.65 μg/kg）、醇类（316.46 μg/kg）为主要挥发性成分。对照组2 中共鉴定出挥发性成分66种，总含量为667.15 μg/kg，其中酮类（382.62 μg/kg）、醛类（92.23 μg/kg）、烃类（69.27 μg/kg）为主要挥发性成分。综上可知，试验组中挥发性成分的种类和总含量均为最高。Sidira 等[15]发现利用干酪乳杆菌ATCC 393 发酵香肠能显著增加香肠挥发性风味化合物的种类与含量；潘晓倩等[16]将植物乳杆菌10M-7 添加到风干香肠中，显著改善和增加风干肠的风味。这说明试验组采用RC4 和B6 发酵能促进腊肉风味物质种类和含量的增加。此外，腊肉制作过程中腌制是必要环节，腌制过程可以起到抑菌防腐的功效，同时可以提高腊肉的保水性，增加腊肉制品的颜色和风味[17]。试验组腌制过程中添加的红曲红与甜菜红，维生素E 和各种香辛料在替代亚硝酸盐的同时，还能提升肉的风味，提高产品的食用价值。

表1 3 种腊肉挥发性风味物质比较Table 1 The volatile flavor compounds of 3 kinds of cured meat

（续表1）

（续表1）

2.5 OAV 分析

挥发性化合物含量与风味特征并没有直接关系，对总体风味的贡献由挥发性组分在风味体系中的浓度和感觉阈值共同决定[18]。根据各挥发性成分的含量和嗅觉阈值计算出其气味活度值（OAV），并选取OAV 大于等于1 的挥发性成分列于表2中。由表2可知，3 组腊肉中共筛选出主体挥发性成分（OAV≥1）20 种，包括烃类1 种、酯类2 种、醛类9 种、酮类2 种、醇类3 种、酚类1 种、醚类2 种，其中，试验组、对照组1、对照组2 分别筛选出16，15，15 种主体挥发性成分，主要为醛类化合物。而试验组中关键挥发性成分（OAV≥30）为D-柠檬烯、壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、茴香脑。

烃类化合物由饱和烃和不饱和烃组成，其中，饱和烃阈值较高，对风味贡献不大，不饱和烃阈值相对较低，对整体风味具有一定的贡献[19]。由表2可知，对照组1 和对照组2 中D-柠檬烯的OAV均小于1，试验组中D-柠檬烯的OAV 较大，为52.87。这是试验组腌制过程中添加了花椒的缘故[20]。D-柠檬烯具有柠檬香味，可赋予腊肉令人愉快的柠檬果香[21]。

酯类化合物由酸和醇经酯化作用而成，通常具有果香，对腊肉制品的整体风味有一定的贡献。异丁酸甲酯、己酸乙烯酯为对腊肉整体风味贡献较大的酯类化合物。其中，异丁酸甲酯具有杏香。试验组中其OAV 明显大于对照组1 和对照组2。此外，己酸乙烯酯具有令人愉快的果香，3 组腊肉中，对照组1 OAV 最大，试验组次之，对照组2 最小。

醛类化合物主要为脂质氧化降解产物，Strecker 降解也能产生挥发性醛，阈值较低，具有较强的挥发性和脂肪香味，是腊肉制品中重要的风味物质[22-24]。由表2可知，3 组腊肉中OAV≥1的醛类化合物有9 种，包括2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、戊醛、己醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、壬醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛。其中，3-甲基-丁醛主要来源于亮氨酸的降解[25]，具有黑巧克力味、坚果味[26]，对腊肉的风味贡献较大。3 组腊肉中，对照组2 的OAV 最大，对照组1 次之，试验组最小。戊醛、己醛、壬醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛均为不饱和脂肪酸氧化产物[27]，其中，己醛由亚油酸氧化产生，Mottram[28]认为己醛会产生令人不愉快的、刺激性的、辛辣的气味。谢凡[29]认为己醛在高浓度时会散发出令人作呕的气味，在低浓度时具有令人愉快的青草香。与对照组1 相比，试验组和对照组2 中己醛的OAV 均明显减小。这说明试验组和对照组2 中令人不愉快的气味得到改善。壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛主要由油酸氧化产生，具有果香、新鲜的油脂香，与对照组1 和对照组2 相比，试验组中壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛的OAV 明显增大，分别达到194.19，770.99，这表明试验组腊肉拥有更浓郁的油脂味。值得注意的是，与对照组1 相比，对照组2 中由脂质氧化降解产生的醛类化合物的OAV 均有所减小。这是对照组2 中添加的亚硝酸盐抑制了腊肉中的脂质氧化所致[30]。

酮类化合物主要来自于脂质氧化和美拉德反应，但阈值远高于其同分异构体的醛类，对整体风味贡献不大。3 组腊肉中对风味贡献较大的酮类化合物为3-羟基-2-丁酮，其主要来自于多不饱和脂肪酸的氧化降解，具有奶香、草莓香[31]。与对照组1 相比，试验组和对照组2 中其OAV 均有所减小，这可能与试验组中添加的香辛料和对照组2 中添加的亚硝酸盐能够抑制腊肉的脂质氧化有关[30，32]。

表2 挥发性风味物质的OAV 分析Table 2 The OAV analysis of volatile flavor compounds of 3 kinds of cured meat

醇类可能由脂质氧化酶对脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解、羰基化合物还原生成，饱和醇阈值较高对风味贡献不大，不饱和醇阈值较低，对风味贡献较大[33]。1-辛烯-3-醇、1-辛炔-3-醇、芳樟醇为对腊肉风味贡献较大的醇类化合物，其中，1-辛烯-3-醇、1-辛炔-3-醇为亚油酸氢过氧化物的降解产物，具有蘑菇香味[34]。3 组腊肉中OAV 的比较结果与3-羟基-2-丁酮一致，可能是二者皆为脂质氧化降解产物的缘故。此外，试验组中芳樟醇的OAV 较大，为25.97，是对照组1 和对照组2 的10倍左右，这可能与试验组中添加的香辛料有关[35]。

此外，茴香脑、二烯丙基二硫醚仅在试验组中被鉴定出，二者均来自于添加的香辛料。如茴香脑为八角、茴香中的挥发性成分[36]，二烯丙基二硫醚为大蒜中的挥发性成分[37]。它们共同赋予腊肉茴香味、大蒜味，使腊肉的整体风味更加醇厚。

3 结论

本研究通过使用发酵乳杆菌RC4、植物乳杆菌B6、红曲红、甜菜红、维生素E、Nisin 以及各种调味物质替代亚硝酸盐制备零添加亚硝酸盐腊肉。并以只添加食盐腌制的腊肉、添加食盐和亚硝酸盐腌制的腊肉为对照组，通过对3 组腊肉亚硝酸盐含量和挥发性风味物质的比较，结果发现零添加亚硝酸盐腊肉中不仅亚硝酸盐含量低，且其挥发性风味物质的种类和含量也较丰富，其关键挥发性成分为D-柠檬烯、壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、茴香脑；与对照组相比，零添加亚硝酸盐腊肉增加了由香辛料引入的挥发性成分（D-柠檬烯、茴香脑），从而使腊肉的整体风味更加浓郁、醇厚。开发零添加亚硝酸盐腊肉制品，研究腊肉的挥发性风味物质，有助于推进腊肉制品风味改善和品质提升，对传统腊肉产业的转型升级、结构调整及人们的健康都有促进作用。