炙甘草汤干预阿霉素致大鼠心肌损害的能量代谢研究*

杭州市第三人民医院 浙江 杭州 310009

目前，阿霉素（ADM）的心脏毒性机制尚未完全明确，氧自由基损伤、能量代谢障碍、钙稳态紊乱、线粒体凋亡途径被认为是阿霉素心脏毒性的主要机制。近年来，众多医者致力于蒽环类药物心脏毒性的防治研究，大量的临床和实验研究已经证明中医药在这方面具有良好疗效[1]。炙甘草汤，又名复脉汤，《伤寒论》记载其主治“心动悸、脉结代”，具有益气滋阴、通阳复脉之功效。临床观察表明，炙甘草汤可有效防治阿霉素的早期心脏毒性、减轻心脏毒性程度、增强患者对蒽环类药物的耐受性、保证化疗的顺利进行[2]。心肌能量代谢的改善是治疗各种心脏疾病的重要理念之一，也是国内外学者的研究热点。因此，本实验通过炙甘草汤改善心肌能量代谢障碍，揭示其有效防治阿霉素心脏毒性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级雄性Wistar大鼠均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物生产许可证SCXK（沪）2017-0005]。15只大鼠均由杭州赫贝科技有限公司实验动物中心饲养，正常进食饮水。

1.2 实验试剂：注射液盐酸多柔比星，购自深圳万乐药业（批号：1806E1）；炙甘草汤，购自杭州市华东医药公司，药物组成：炙甘草12g，生地黄30g，生姜、桂枝各9g，人参、阿胶各6g，麦门冬、麻仁各10g，大枣20g。熬制方法：将药材加水适量，大火煎开后，小火浓煎至50ml，生药浓度为2.24g/ml，备用；苏木精，购自Sigma公司（货号H9627，批号：SLBN3249V）；伊红，购自Sigma公司（货号：E6003，批号：62R80915X）；心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒，购自武汉优尔生公司（货号：SEA478Ra，批号：L181108550）；三磷酸腺苷（ATP）和二磷酸腺苷（ADP）的二钠标准品，购自北京索莱宝科技有限公司，纯度98%以上；乙腈（色谱纯），购自美国TEDIA公司；甲醇（色谱纯），购自Sigma-Aldrich公司；磷酸（分析纯），购自杭州高晶精密化工有限公司；磷酸氢二钠（分析纯），购自湖州湖试化学试剂有限公司；磷酸二氢钠（分析纯），购自江苏强盛功能化学股份有限公司。

1.3 实验仪器：轮转式切片机：RM2235型，Leica公司；显微镜：BX43型，Olympus公司；隔水式恒温培养箱：PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司；移液器：北京大龙兴创实验仪器有限公司；全波长酶标仪：SpectraMax Plus 384型，美国MD公司；高效液相色谱系统：日本岛津shimadzu 20AT；数显恒温水浴锅：HH-2，上海常思工贸有限公司；高速离心机：MIKRO 22R，德国Hettich产品。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 模型建立与分组：15只Wistar大鼠分5组，每组3只，分别为对照组、模型组、预防组、治疗组和防治结合组。实验前2周预防组及防治结合组（结合组）开始灌胃炙甘草汤（10ml/kg），每日2次，第3周开始分别在模型组、预防组、治疗组和结合组尾静脉注射ADM（4mg/kg），5天1次，给药3次，同时，治疗组及结合组在尾静脉注射当天，继续予炙甘草汤灌胃。对照组以相应体积的生理盐水灌胃。各组大鼠在第1次尾静脉注射后20d，处死大鼠后收集心脏，分2管冻存，用于检测心肌ATP和ADP含量。

1.4.2 血清的采集与保存：每组大鼠分别于灌胃前（T1）和麻醉前（T2）通过断尾取血0.2ml，麻醉30分钟后（T3），通过摘除眼球取血0.2ml。将血样分别注入已编号的EP管中，静置30min后，以4℃、2000r/min离心5min，吸取血清后，置于-80℃保存备用，用于检测血清cTnI水平。

1.4.3 ELISA检测各组大鼠血清cTnI水平：根据cTnI检测试剂盒，配制好标准溶液，设置标准孔、待测样品孔及空白孔。在标准孔中加入不同浓度的标准品100μl，空白孔中加入标准品稀释液100μl，剩余孔中加入各组大鼠血清100μl，置于37℃温育1h。随后吸弃液体，将A试剂工作液100μl加入各孔，再次置于37℃温育1h。吸弃液体，清洗3次后，将B试剂工作液100μl加入每孔，37℃温育1h。清洗后，于每孔加入90μlTMB底物溶液，置于37℃温育30min后，终止反应，并于酶标仪450nm下读数统计。

1.4.4 高效液相色谱法检测各组大鼠心肌组织中ADP、ATP的表达水平：分述如下。

1.4.4.1 对照品溶液的配制：准确称取ATP和ADP标准品溶解于超纯水中，作为储备液，利用超纯水将储备液分别稀释成 200.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0和1.0mg/L系列标准液，置于4℃冰箱保存。

1.4.4.2 心肌样品的制备：从超低温冰箱中取出小鼠心肌样本，准确称取一定量小鼠心肌组织，并将组织置于玻璃匀浆器中。将预冷的0.4mol/L的高氯酸溶液，以10ml/g比例加入匀浆器中，置于冰浴中匀浆。将匀浆液转移至10ml具塞离心管中，以4℃、10000r/min离心5min。取0.4ml上清液，加入4℃预冷的2.0mol/L氢氧化钾溶液20μl，混匀后，4℃、10000r/min离心10min。吸取上清液后，于0.45μm微孔滤膜过滤，取过滤液20μl进高效液相色谱系统分析。

1.4.4.3 色谱条件：色谱柱为：ODS C18 column(5µm,150mm×4.6mm)；流动相为100mmol/L磷酸盐缓冲液（含12mmol/L磷酸氢二钠和88mmol/L磷酸二氢钠，pH=6.5）-甲醇=99.9-0.1（v/v），流速 0.8ml/min，柱温25℃，紫外检测波长254nm。

1.5 数据统计：所有数据均由SPSS 13.0软件进行统计分析，GraphPad Prism6.0统计软件进行作图。计量资料以均数±标准差（±s）表示，若方差齐，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK检验。若方差不齐，则采用秩和检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量的变化：在ADM造模前，各组大鼠体重未显示出明显差异(P＞0.05)，表明炙甘草汤灌胃对大鼠体质量无明显影响；在开始尾静脉注射ADM后，模型组体质量与对照组比较，有统计学差异（P＜0.05），其余组无显著性差异(P＞0.05)。一定程度说明炙甘草汤可以缓解ADM的相关毒副反应。见表1。

表1 各组大鼠ADM造模前后体质量的变化（±s，g）

表1 各组大鼠ADM造模前后体质量的变化（±s，g）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别对照组模型组治疗组预防组结合组例数造模后3 3 3 3 3造模前1d 294.00±11.53 291.00±23.52 289.00±7.21 290.33±15.95 288.00±15.59 11d 300.67±13.65 306.00±25.16 300.00±4.58 310.00±13.75 289.00±12.00 14d 304.33±14.01 300.67±20.65 296.67±4.93 308.67±15.95 296.00±15.87 21d 317.67±29.67 291.33±16.07*300.33±1.15 302.67±11.85 288.67±17.16 28d 336.00±25.12 273.33±20.82**288.67±8.14 288.00±9.64 271.33±18.50*31d 338.67±25.15 274.67±19.60**286.67±9.07 289.33±10.02 276.67±17.21

2.2 各组大鼠血清cTnI含量：见表2。对照组与模型组cTnI含量变化为T1＜T2＜T3，预防组cTnI含量变化为T2＜T1＜T3，治疗组与结合组cTnI含量变化为T2＜T3＜T1。与对照组比较，均显著升高（P＜0.01），与模型组比较，结合组T2时间点呈下降趋势（P＜0.05）；与模型组比较，预防组、治疗组与结合组T3时间点均显著下降（P＜0.01），其余组间无显著性差异(P＞0.05)。

表2 各组大鼠血清样本cTnI含量（±s，n=3）

表2 各组大鼠血清样本cTnI含量（±s，n=3）

注：与对照组比较，▲P＜0.01；与模型组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01。

T3（麻醉后）148.88±12.65 502.36±17.74▲412.44±25.68▲○○396.77±18.11▲○○379.29± 8.80▲○○组别对照组模型组预防组治疗组结合组T1（灌胃前）115.78±15.17 424.48±22.90▲399.54±10.13▲441.57±50.09▲388.32± 8.66▲T2（麻醉前）136.84±22.02 469.59±67.28▲394.22±14.88▲369.32± 6.49▲360.90± 7.23▲○

2.3 各组ADP和ATP的表达水平比较：见表3。检测结果显示，与对照组比较，模型组ATP和ADP浓度均下降（P＜0.05），表明造模成功。预防组与对照组比较ATP浓度降低（P＜0.05），但是与模型组比较明显升高（P＜0.05），ADP影响不显著，说明中药预防对ATP浓度具有效果。然而，治疗组与模型组比较，ATP和ADP差异均不显著（P＞0.05），说明中药治疗对ATP和ADP浓度的影响并不显著。与模型组和治疗组比较，结合组ATP浓度升高（P＜0.05），但与预防组比较差异不显著（P＞0.05）；结合组ADP与模型组比较差异不显著(P＞0.05)。以上结果说明预防组对ATP浓度影响较大，治疗组和结合组对ATP和ADP影响并不显著。

表3 各组样本中ATP和ADP含量（±s）

表3 各组样本中ATP和ADP含量（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

ADP（mg/L）183.48±4.31 129.85±19.22*136.41±4.08*146.28±20.61*137.16±4.73*组别对照组模型组预防组治疗组结合组例数3 3 3 3 3 ATP（mg/L）604.42±53.41 270.75±18.61*487.23±53.95*▲256.23±28.39*397.85±35.39*▲

3 讨论

阿霉素是一种抗肿瘤抗生素药物，其抗肿瘤作用主要是通过插入脱氧核糖核酸双链，抑制拓扑异构酶Ⅱ和诱导细胞凋亡来实现的[3]。正常心脏的能量代谢过程对维持机体的生理功能具有重要意义，ATP及ADP是最常见的心肌高能磷酸化合物，可作为心肌细胞进行生命活动的直接能源供给者。阿霉素多次给药后，产生的糖苷代谢物和次级醇代谢物通过活性氧（ROS）机制引发心肌损伤。心肌中的线粒体功能受损，ATP值也会随之下降，心脏生理活动需要的能量供给将受到影响，从而导致体内的能量代谢通路发生紊乱[4]。三大营养素的最终代谢通路，分布在线粒体内，线粒体的形状、功能与细胞骨架密切相关，心肌的损伤可以导致细胞骨架的改变，同时各种损伤原因均可导致线粒体功能的损伤，两者相互影响相互作用，长期累积作用导致慢性心力衰竭[5]。心衰发生后，供养和耗氧的平衡失调，线粒体的功能改变，使ATP生成和利用均减少，将导致心功能的进一步恶化[6]。

根据阿霉素导致的心脏毒性表现症状，中医学将其归属于“心悸”“怔忡”“心痹”“虚劳”等病证范畴。心悸、怔忡的病因，多责之于痰、火、瘀、虚、惊等众多因素。ADM所致心脏毒性的病机为药毒炽热、耗气伤阴、心神失养，或久病体虚、正气不复、心气不足、心阳不振所致，应采用益气养阴温阳等治法进行治疗。炙甘草汤方中，生地黄滋阴养血为君药；辅以炙甘草、人参、大枣补益心脾，以资气血生化之源，阿胶、麦冬、麻仁滋心阴，养心血，充血脉，共为臣药；佐以桂枝、生姜辛行温通，温心阳，通血脉，诸厚味滋腻之品得姜、桂则滋而不腻。临床中，炙甘草汤治疗慢性心力衰竭的疗效显著，且安全性高，副反应少[7]。有学者认为炙甘草汤可以显著增强心肌收缩力，改善心肌结构，同时促进其细胞功能恢复，可有效增强心肌纤维线粒体的氧化与代谢，起到很好的强心效果[8]。

cTnI是心肌损伤的标志之一，本实验以尾静脉注射ADM建立大鼠心肌损伤模型，在不同阶段进行炙甘草汤干预，结果显示，经ADM干预后，模型组的cTnI含量明显升高，而与之相反，预防组在ADM干预后cTnI在一定阶段也随之降低，治疗组及防治结合组，均显示出炙甘草汤干预后，可减少cTnI的含量，同时，与模型组比较，预防组、治疗组与防治结合组均显著下降，表明炙甘草汤对ADM引起的心肌损伤具有修复作用。通过测定ATP及ADP的含量，结果显示ADM干预后，模型组的ATP及ADP含量明显减少，即说明心肌损伤已导致能量代谢障碍，而炙甘草汤干预后，一定程度上，可增加ATP及ADP的生成，说明在预防、治疗ADM引起的心脏毒性过程中，炙甘草汤均具有较好的疗效。然而炙甘草汤改善能量代谢障碍的具体环节、对线粒体结构和功能的作用，需要后续实验进行进一步的研究。