活络效灵丹对心肌缺血大鼠急性损伤的保护作用*

童静燕 张建斌 秦宇芬

1 兰溪市妇幼保健院 浙江 兰溪 321100

2 湖州市中医院 浙江 湖州 313000

冠心病是临床上较为常见的疾病，发病率较高，急性心肌梗死是其主要并发症之一，具有发病急骤、病情严重、致死率高等特点。目前，临床上的治疗方式以溶栓术、经皮冠状动脉介入术、抗凝等为主，可恢复冠状动脉血运，减少心肌梗死面积，恢复心脏结构与功能，但在恢复血运的同时，再灌注可损伤心肌组织，破坏心脏结构与功能，且现有方法无法有效避免[1]。心肌缺血再灌注损伤(MIRI)由多种因素引起，包括氧自由基(OFR)增多、Ca2+超载、炎症因子等有关[2]，治疗过程中往往具有两面性，如使用抗氧化剂治疗，会对心肌组织造成损伤，因此，如何有效预防治疗MIRI已成为临床研究的重点。

活络效灵丹（当归、丹参、乳香、没药）源于《医学衷中参西录》，由名医张锡纯先生所著，组方简练，可通络止痛、祛瘀生新[3]。活络效灵丹在祛瘀、治疗内外创伤、改善关节炎症、疼痛及糖尿病并发症等方面疗效较佳；且其具有多种药理活性成分包括阿魏酸、香草酸、丹参酮、丹酚酸、原儿茶醛、黄酮及其糖苷、三萜和三萜皂苷等[4]。本研究采用活络效灵丹预处理MIRI模型大鼠，旨在探讨活络效灵丹对冠状动脉结扎所致大鼠急性心肌缺血再灌注的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物：成年雄性SD大鼠，200～230g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016；处于温度23～25℃，湿度55%～70%的环境中适应性喂养1w，期间均采用标准食物饲养，允许自由饮水。

1.2 主要实验试剂与仪器：活络效灵丹购于北京同仁堂(组方：当归、丹参、生没药、生乳香各15g)；肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB，IC-CKMB-Hu)、乳酸脱氢酶(LDH，ICLDH-Hu)、髓过氧化物酶(MPO，IC-MPO-p)、超氧化物歧化酶(SOD，IC-SOD-Ra)、丙二醛(MDA，IC-MDA-Ge)、白细胞介素-10(IL-10，IC-IL10-p)试剂盒购于IC/IBL；肿瘤坏死因子-α(TNF-α，MM-0180R2)、IL-1β、IL-6(MM-0047R2、MM-0190R2)试剂盒购于酶免。Micro17R低温高速离心机(Thermo)；PL3504生物信号采集系统(ADI)；AE2000显微镜(Motic)。

1.3 实验分组与MIRI模型制备：1w喂养完毕后，SD大鼠随机分为活络效灵丹低、高剂量组(2.7、5.4g/kg·d-1活络效灵丹)、假手术组、模型组(等体积生理盐水)，各10只，均腹腔注射给药7d，末次给药30min后制备MIRI模型。

麻醉大鼠，固定，钝性分离并暴露气管，切开后给予机械通气，设置相关参数。分离左侧颈总动脉于气管插管后，于动脉处放置生物信号采集系统等相关内置管，收集信息。切开左胸暴露心脏，剥脱心包，采用小型乙烯基管通过距左心耳2mm处，随后平衡15min，完毕对冠状动脉进行套圈并结扎。结扎左前降支（LAD）诱导心肌缺血，30min后再灌注120min。假手术组不结扎LAD仅套圈，其余组均进行上述操作。心电图（EKG）观察，当典型抬高的ST段下降＞1/2时，即MIRI模型制备成功。颈主动脉采血，离心收集上清液，－20℃冷冻保存。立即处死各组大鼠，打开胸腔并取出心脏，分离缺血梗死区域，置于液氮冷冻做进一步分析。

1.4 心脏功能参数的测定：模型制备完毕稳定数分钟后，依据采集系统自我分析的数据，记录射血分数（EF）、左心室缩短分数（FS）、左室舒张压（LVDP）等相关心功能参数。

1.5 心肌梗死面积测定：取各组大鼠左心室称重切片5段（1～2mm厚），37℃避光置1%TTC溶液中孵育15 min，染色完毕后进行固定，随后拍照。软件计算红色非梗死区和白色梗死区面积，并计算心肌梗死面积。

1.6 HE染色：心肌切片，约4μm，固定，随后清洗，苏木素染色0.5s，将浮色洗去，1%盐酸酒精进行分化1～3s，弱氨水浸润心肌切片5～10s，利用0.5%伊红溶液复染30～60s，随后再利用梯度乙醇依次冲洗切片2s，封片后显微镜下观察心肌组织形态学的变化。

1.7 血清心肌酶活性测定：全自动生化分析仪检测离心并收集各组大鼠颈主动脉血的上清液中的CK-MB、LDH活性。

1.8 心肌组织中MPO、SOD活性、MDA含量及炎性因子水平的测定：参照相关试剂盒说明，测定心肌组织中MPO、SOD活性、MDA水平；同时采用ELISA法对IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平进行测定。

1.9 统计学处理：应用SPSS 16.00分析，所有数据以均值±标准差（-x±s）表示，两组间比较采用Student t test。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 活络效灵丹对心脏功能的影响：对各组大鼠再灌注120min后的心脏功能指标参数进行记录。由图1可知，与假手术组比较，模型组LVDP、EF、FS水平均显著性降低(P＜0.01)；与模型组比较，活络效灵丹高剂量组LVDP、EF、FS水平均显著性升高(P＜0.01)，活络效灵丹低剂量组除EF水平无显著性差异(P＞0.05)外，LVDP、FS水平均显著性升高(P＜0.05，P＜0.01)。

图1 心脏功能参数的比较

2.2 活络效灵丹对心肌梗死面积的影响：采用TTC染色法测定心梗面积，由图2可知，假手术组心肌未见梗死，而模型组可见大片心肌切片呈白色，即梗死区较假手术组明显增多。与模型组比较，活络效灵丹处理可显著减少大鼠心肌梗死面积，且呈剂量依赖性。

图2 TTC染色下心肌梗死面积的比较

2.3 活络效灵丹对心肌组织病理的影响：采用HE染色分析心肌组织病理变化，由图3可知，与假手术组比较，模型组具有紊乱、破裂溶解的心肌结构，且炎性细胞大量浸润，呈局部变性坏死，间质水肿充血。活络效灵丹处理干预后，可见较整齐的心肌纤维排列，炎性细胞浸润较模型组明显减少，且间质肿胀程度减轻，其中活络效灵丹高剂量组心肌损伤改善显著。

图3 HE染色下心肌组织病理改变的比较

2.4 活络效灵丹对血清心肌酶活性的影响：全自动生化分析仪测定血清CK-MB、LDH活性，由图4可知，与假手术组比较，模型组CK-MB、LDH表达活性均显著性上升(P＜0.01)；与模型组比较，活络效灵丹高剂量组CK-MB、LDH表达活性均显著性降低(P＜0.01)，活络效灵丹低剂量组LDH表达活性显著性降低(P＜0.05)，而CK-MB表达活性水平差异无统计学意义(P＞0.05)。

图4 活络效灵丹对血清心肌酶活性的影响

2.5 活络效灵丹对心肌组织MPO、SOD、MDA水平的影响：由图5可知，与假手术组比较，模型组显著上调MPO、MDA水平(P＜0.01)，SOD水平降低(P＜0.05)；与模型组比较，活络效灵丹低剂量组显著下调MDA含量水平(P＜0.05)，而MPO、SOD活性水平无显著性差异(P＞0.05)；活络效灵丹高剂量组显著下调MPO、MDA水平(P＜0.01)，升高SOD水平(P＜0.05)。

图5 各组心肌组织MPO、MDA、SOD水平的比较

2.6 活络效灵丹对心肌组织中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影响：ELISA法测定IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平，由图6可知，与假手术组比较，模型组显著上调IL-1β、IL-6、TNF-α水平(P＜0.01)，而IL-10水平显著性降低(P＜0.01)；与模型组比较，活络效灵丹高剂量组显著下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平(P＜0.05或P＜0.01)，IL-10水平显著性升高(P＜0.01)，活络效灵丹低剂量组显著下调IL-1β、IL-6水平(P＜0.05)，而IL-10、TNF-α水平差异无统计学意义(P＞0.05)。

图6 各组心肌组织中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

3 讨论

MIRI属“胸痹心痛”“心悸”等范畴，多与素体阳虚、饮食不节、情志失调等相关，胸阳不展、心阴内耗，恣肥喜甘日久伤脾、酿湿生痰，或忧思伤脾，郁怒伤肝等，均可致气滞、心脉痹阻。故而应以舒经活络、活血祛瘀生新为其治疗之根本。活络效灵丹方中当归可活血补血，养肝通心脉；丹参除烦养心，可破宿血生新，配以当归，一可使气血各有所归，二可扩大活血祛瘀生新之效；乳香、没药活血生肌，定痛散瘀，且皆为活血止痛药，二者配伍，可流通经络而宣通脏腑，进一步扩大消肿生肌、活血止痛之功。调和四药，共奏排毒生肌、养血活血、舒经活络、祛瘀生新之效。切合MIRI病因病机，恰为对症之方。又兼药理学研究表明，当归有诸多活性成分，其中酚类化合物阿魏酸具有抗氧化应激、清除自由基及降血脂等作用，且其钠盐可通过抑制血栓素A2（TXA2）、MDA生成，从而起到防止血栓作用；当归还可通过再生海马神经、调节神经递质起到抗抑郁作用[5]；丹参活性成分对血管有扩张作用，改善缺血心肌的血液循环，减轻心肌损伤等作用[6]。

综上，采用活络效灵丹预处理对于冠状动脉结扎引起的MIRI具有显著的保护作用，可能与改善心脏结构功能、缩小心肌梗死面积、抑制血清心肌酶CK-MB、LDH活性、抗OFR损伤、抗脂质过氧化、维持Ca2+平衡、调节炎性细胞因子表达来抑制炎症反应等有关。