荞麦芽菜黄酮类物质含量和胰蛋白酶抑制率变化研究

李静舒贺东亮

(1.山西开放大学，山西 太原 030027；2.太原工业学院，山西 太原 030008)

荞麦作为一种兼具食用和药用双重功能的作物，近年来受到越来越多研究人员的关注。荞麦不仅含有丰富的营养物质，如蛋白质、维生素、纤维素等[1]，还含有一些功能性物质，如黄酮类、多酚类和甾醇类等，这些物质具有抗癌、抗氧化、抗菌消炎、降糖降脂、抗高血压、减肥等药理活性[2-4]。

但是荞麦籽粒中含有蛋白酶抑制剂，会钝化蛋白酶的活性，使得胰蛋白酶在完成对蛋白质的消化时受阻，造成人体消化功能紊乱，而且荞麦中很多蛋白对蛋白酶低度敏感，如果荞麦直接被人体食用的话，就会使荞麦蛋白质在人体中的消化吸收率远远低于其它麦类和豆类，有报道称，某些人食用荞麦后，会产生如腹胀等消化不良的症状。

黄酮类化合物是荞麦特有，而其它禾谷类粮食作物中没有的一种功能性成分。作为荞麦属植物已知主要活性成分之一，其具有很高的药用价值，在生物抗氧化、抗肿瘤以及降血糖、血脂等方面有重要作用[5,6]。苦荞麦中黄酮类化合物的主要成分是芦丁，由于芦丁易溶于水，所以其在多水的条件中加工时，很容易被芦丁降解酶所分解，降低荞麦的保健功能。

有报道证明，荞麦经过萌发处理能够改善并提高其营养价值[7,8]。不仅蛋白类和黄酮类物质含量发生变化，还产生了易于吸收的单糖，脂肪酸趋于平衡，维生素、多酚类和矿物质的含量也会有所提高，各种营养成分更利于人体吸收利用[9,10]。同时，由于化学成分发生变化，荞麦所含营养物质和口感较籽粒时期有大幅度提高[11]。荞麦芽菜，作为一种新型的蔬菜，与荞麦相比，具有更高质量的蛋白质、更合理的氨基酸组成、更多的不饱和脂肪酸以及更高生物性的黄酮类化合物，营养成分更易被人体吸收利用。而且，荞麦芽菜的口感要比普通市面上的豆芽更为软嫩，没有豆腥味道，很容易被大多数人所接受[12]。

本试验以甜荞和苦荞2个栽培品种为研究目标，拟研究萌发后期的荞麦芽中活性物质，如胰蛋白酶抑制率、黄酮类物质，随萌发天数增长的变化趋势，开展对荞麦相关功能因子的动态化分析，为深入探究荞麦活性物质的生理作用，开展荞麦的精深加工、开发荞麦产品提供一定的理论依据，对于贫困山区农民群众脱贫致富，将地区资源优势转化为经济优势具有深远意义。

1 试验材料

1.1 试验条件

试验于2019年3—6月在山西省太原市进行。山西省太原市属北温带大陆性气候，年平均气温9.5℃，年降雨量500mm，无霜期140～190d。

1.2 试验材料

供试品种为“晋荞1号”(甜荞)和“晋荞2号”(苦荞)，由山西省农业科学院提供。

1.3 试验试剂

芦丁标准品购自上海试剂二厂；胰蛋白酶购自Solarbio公司；苯甲酰—DL—精氨酸对硝基苯胺(BApNA)购自Sigma公司。其余均为国产分析纯试剂。

2 试验方法

本试验采用半人工控制条件下培养荞麦芽菜，即仅仅人工控制土壤含水量这一条件，光照、温度等均为自然条件。

2.1 苦荞和甜荞萌发

选取大小、颜色、成熟度均匀的荞麦种子，于纯净水中浸泡24h后，沥干水分。方形不锈钢盘中放入灭菌纱布，将种子置于其上，用喷壶于每天8∶00、15∶00、22∶00各喷水1次，保持盘中水分。待苦荞和甜荞种子发芽后记为采样起点，每天定时定量采样。取样后烘干，粉碎，贴好标签于4℃冰箱中保存。连续采集10d。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 芦丁标准曲线的绘制

荞麦中的黄酮类物质主要是芦丁，总黄酮含量以芦丁计算。称取芦丁标准品1mg溶于10mL的30%乙醇溶液中，得到浓度为0.1mg·mL-1的芦丁标准品溶液，深色玻璃瓶保存于4℃冰箱。取芦丁标准品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL分别加入10mL试管中，编号①、②、③、④、⑤，加5%亚硝酸钠水溶液0.6mL，静置5min，加10%硝酸铝水溶液0.6mL，摇匀后静置5min，加1.0mol·L-1氢氧化钠水溶液5．0mL，静置10min，加30%乙醇至刻度，静置15min，利用紫外分光光度计，测定其在500nm处的吸收值[13]。

2.2.2 荞麦芽菜黄酮类物质提取液的制备

取一定量荞麦芽样品，加入65%乙醇，于60℃下提取3h后，10000r·min-1下离心10min，弃去沉淀，取1mL上清于10mL试管中，同2.2.1中方法，测定吸收值，试验重复3次。

2.2.3 荞麦芽菜黄酮类物质浓度

根据所测吸光度，代入2.2.1中所得标准曲线，得出总黄酮类物质的浓度。

2.3 胰蛋白酶抑制剂活性测定

2.3.1 荞麦芽菜蛋白提取液的制备

取一定量荞麦芽样品，加入Tris-HCl缓冲液(0.05mol·L-1，含0.15mol·L-1NaCl，pH7.8)，4℃下研磨提取1h，10000r·min-1离心10min，弃去沉淀，保留上清液，胰蛋白酶抑制剂活性待测。

2.3.2 胰蛋白酶抑制剂活性测定

胰蛋白酶抑制剂活性测定参考Stauffer C E[14]的方法，有少许调整改进。以BApNA为底物，二甲基亚砜为溶剂。底物BApNA在胰蛋白酶的作用下水解，会产生黄色产物PNA，该产物在410nm处有吸收。

取2.3.1中制备的提取液1mL，加入20μL的胰蛋白酶(1mg·L-1)和2.5mL测活缓冲液，混匀，37℃下水浴锅中保温10min，快速加入底物BApNA(150mmol·L-1)15μL，同温度下继续保温10min，加入0.5mL(300g·L-1)的乙酸终止反应。以测活体系中加入缓冲液为对照，测定410nm的波长下反应体系中由产物PNA所产生的吸收值，试验重复3次。

2.3.3 抑制率计算

式中，A0为对照吸光度；A1为样品吸光度。

3 试验结果与分析

3.1 芦丁标准曲线

以加入标品溶液的浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光值(OD500)为纵坐标，得到线性回归，求得标准曲线：

Y=4.571X-0.001，R2=0.9924

3.2 荞麦芽总黄酮物质含量变化

甜荞籽粒在播种5d后发芽。甜荞籽粒萌发后，随着时间的增加，甜荞芽菜中黄酮类含量呈现先增加后平稳的趋势，如图1所示。在发芽1～7d，黄酮类含量呈上升趋势；在8～10d，黄酮类含量保持平稳，略有降低，差异不显著，在第7天时到达甜荞幼苗总黄酮含量的顶点，为1.46mg·g-1。

图1 甜荞芽总黄酮含量的变化曲线

苦荞籽粒在播种3d后发芽。由图2可以看出，苦荞籽粒萌发后，随着时间的增加，苦荞芽中总黄酮类含量呈现先增加后平稳的趋势。在发芽后1～6d，黄酮类含量呈上升趋势；在7～10d，黄酮类含量呈平稳趋势，在第6天到达苦荞芽菜总黄酮含量的顶点，为41.02mg·g-1。

图2 苦荞芽总黄酮含量的变化曲线

3.3 荞麦芽胰蛋白酶抑制剂含量变化

由图3可以看出，甜荞籽粒发芽后第1天时，胰蛋白酶抑制率为10.2%；到第10天时胰蛋白酶抑制剂活性降到很低，几乎检测不出来。

图3 甜荞芽胰蛋白酶抑制率的变化曲线

由图4可以看出，苦荞籽粒发芽后第1天时，胰蛋白酶抑制率为17.15%；到第10天时胰蛋白酶抑制率降到1.94%。

图4 苦荞芽胰蛋白酶抑制率的变化曲线

4 结果与讨论

荞麦中含有一种特殊的生物活性物质，即黄酮类物质，这是其它普通粮谷类作物如小麦、水稻等所不具备的。黄酮类物质的食疗及保健功能日益受到人们的重视。甜荞和苦荞籽粒萌发后形成荞麦芽，黄酮类物质含量均有所增加，说明萌发可提高荞麦的保健价值。但是随着发芽时间的延长，总黄酮含量有所下降。甜荞出芽后第6～10天，苦荞出芽后第5～7天的总黄酮含量较高。荞麦籽粒的蛋白质虽然有着合理的氨基酸配比，但该蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性也较高，影响人体对荞麦蛋白的吸收利用。研究表明，在荞麦籽粒出芽的初期，甜荞苗和苦荞苗均表现出一定的胰蛋白酶抑制活性，但随着萌发天数的增加，其活性逐渐降低。在出芽后第10天，几乎检测不出胰蛋白酶抑制剂活性。萌发处理使得荞麦籽粒的胰蛋白酶抑制剂活性降低，从而使蛋白的消化利用率有所提高。

荞麦芽菜是荞麦种子经过萌发后，生长成的芽苗。作为一种新型蔬菜，其既能够使荞麦中的营养成分得到改善，又能够使荞麦资源得到充分开发利用。该试验结果可以帮助确定荞麦芽菜的最佳采摘时间，为荞麦芽菜的生产提供一定理论依据。