益肾化浊方对快速老化P8小鼠学习记忆能力及精神行为影响*

于 臻，程汝珍，张 伟，吴 丹，张琳琳

（1.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120；2.天津中医药大学，天津 301617；3.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）以进行性记忆减退及其他认知功能障碍、精神行为异常和日常生活能力下降为主要临床症状[1]，90%于65岁以后发病，是最常见的痴呆原因[2]。目前我国AD患者超过1 000万，是全球AD患者数量最多的国家[3]。前期研究发现，益肾化浊方可有效改善轻度AD患者临床症状[4]。在此基础上，本研究选取3月龄SAMP8小鼠作为研究对象，旨在观察益肾化浊方对其学习记忆能力及精神行为的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级3月龄雄性SAMP8小鼠20只，体质量20～25 g，3月龄雄性抗快速老化小鼠（senescence-accelerated-resistant mouse-1，SAMR1）小鼠10只，体质量20～25 g，均由天津中医药大学第一附属医院提供。饲养于天津市南开医院实验动物中心，明暗交替12 h/12 h，室温23～25℃，相对湿度为50%～60%，自由摄食与饮水。实验过程中所有操作遵循《实验动物管理与使用指南》[5]。

1.2 药物与主要仪器 益肾化浊方组成：女贞子10 g，淫羊藿 10 g，肉苁蓉 10 g，制何首乌 6 g，石菖蒲6 g，川芎6 g，一次性购于天津中医药大学第二附属医院中药房。为保证灌胃期间药物的稳定性[6]，便于保存同时利于质量控制，将上述中药饮片提取浓缩、真空冷冻干燥后制成中药复方冻干粉，于阴凉干燥处密封保存备用。

旋转蒸发仪（郑州英峪予华仪器有限公司，RE-201D），原位冻干机（无锡沃信仪器有限公司，VS-502FD），Morris水迷宫视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司ZS-001），ANY-maze动物行为分析系统（美国Stoelting公司）及旷场实验检测箱，高架十字迷宫实验视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司，ZS-DSG）。

1.3 分组及干预 将20只SAMP8小鼠随机分成模型（SAMP8）组、益肾化浊方（YSHZ）组各 10只，10只SAMR1小鼠作为对照组。各组小鼠进行灌胃干预：YSHZ组予以益肾化浊方，模型组和对照组予以蒸馏水。YSHZ组给药剂量参考《药理实验方法学》[7]中体表面积法，根据人（70 kg）与小白鼠（20 g）之间0.002 6的折算系数进行计算，按患者每日服用益肾化浊方生药48 g，则20 g小鼠每日生药量为0.124 8 g，即生药6.24 g/kg，将上述益肾化浊方中药复方冻干粉用蒸馏水配成相应浓度的药液。各组小鼠每日灌胃1次，持续12周。

1.4 Morris水迷宫 灌胃结束后参照Vorhees等[8]实验方案，向水迷宫的圆形水池中注入清水使水深达30 cm，加入黑色复配着色剂使水呈现为不透明的黑色，水温控制在21～22℃。将黑色的目标平台隐藏于第一象限水面下1 cm，以进行定位航行实验。

1.4.1 定位航行实验 每天每只小鼠进行4次检测，共持续5 d。小鼠入水后，系统自动跟踪记录数据。若小鼠在65 s内登上平台，则系统自动停止记录，逃避潜伏期时间即为记录时间；若超过65 s，则逃避潜伏期时间系统自动记录为65 s，同时引导小鼠到平台上停留10 s。

1.4.2 空间探索实验 定向航行实验结束后次日将水池中平台移除，每只小鼠检测1次，从平台对侧位置即第三象限内投放，系统自动跟踪记录小鼠入水后65 s内穿越平台区域的次数。

1.5 旷场实验 将小鼠放于清洁的方形旷场实验检测箱内，使用ANY-maze动物行为分析系统进行数据采集，以记录5 min内各只小鼠的活动总距离及进入中心区域的次数。每次小鼠测试结束后，均用酒精充分擦拭检测箱以防小鼠间气味或者脏物的干扰。

1.6 高架十字迷宫 参照Walf等[9]实验方案，将小鼠置于仪器中开放臂和封闭臂的连接处，面朝实验者对侧的开放臂，用高架十字迷宫实验视频分析系统记录其5 min内的活动情况，并计算其在开放臂内停留时间的比例。同旷场实验，在每次测试后用酒精擦拭仪器，待其挥发后再进行下只小鼠测验。

1.7 统计方法 采用SPSS 19.0统计分析软件进行处理，正态分布数据计量资料以均值、标准差（）表示；多组间比较采用方差分析，连续变量的比较采用重复测量的方差分析。非正态分布数据计量资料以中位数、四分间距M（IQR）表示，组间比较采用非参数Kruskal-Wallis检验，以α=0.05为检验水准，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益肾化浊方对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响

2.1.1 平均游泳速度 各组小鼠5 d的游泳速度数据采用重复测量方差分析，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明各组间小鼠体能情况基本相同，可排除游泳速度对逃避潜伏期的影响。见表1。

表1 各组小鼠游泳速度估算的边际均值比较（±s）

表1 各组小鼠游泳速度估算的边际均值比较（±s）

分组 n 平均游泳速度/cm·s-1）SAMR1 组 10 18.65±1.04 SAMP8 组 10 16.85±1.09 YSHZ 组 10 17.69±1.04

2.1.2 逃避潜伏期 各组小鼠5 d逃避潜伏期时间比较采用重复测量方差分析，经Mauchly球形检验（P＜0.05），采用 Greenhouse-Geisser进行校正，结果显示：时间因素P＜0.05，说明各组小鼠的逃避潜伏期均随时间的变化而变化，且时间与分组因素存在交互作用（P＜0.05），说明不同组的逃避潜伏期不相等。事后多重比较结果显示：与SAMR1组相比，SAMP8组及YSHZ组小鼠逃避潜伏期均显著延长（P＜0.05）；与SAMP8组相比，YSHZ组小鼠避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠逃避潜伏期估算的边际均值比较（±s）

表2 各组小鼠逃避潜伏期估算的边际均值比较（±s）

注：与SAMR1组比较，*P＜0.05；与SAMP8组比较，#P＜0.05。

分组 n 逃避潜伏期/s SAMR1 组 10 32.57±1.49 SAMP8 组 10 56.52±1.49*YSHZ 组 10 39.01±1.49*#

2.1.3 穿越平台次数 经Kruskal-Wallis检验，结果显示：与SAMR1组相比，SAMP8组小鼠穿越平台次数显著减少（P＜0.05），而YSHZ组与之相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与 SAMP8组相比，YSHZ组小鼠穿越平台次数明显增加（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠穿越平台次数比较（M（IQR））

2.2 益肾化浊方对SAMP8小鼠精神行为的影响

2.2.1 旷场实验结果 经单因素方差分析发现：与SAMR1组小鼠相比，SAMP8组小鼠活动总距离及进入中心区域次数均显著减少（P＜0.05），而YSHZ组与之相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与SAMP8组相比，YSHZ组小鼠活动总距离及进入中心区域次数均显著增加（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠旷场实验结果比较（±s）

表4 各组小鼠旷场实验结果比较（±s）

注：与SAMR1组比较，*P＜0.05；与SAMP8组比较，#P＜0.05。

分组 进入中心区域次数SAMR1 组 17.50±5.72 n 10 SAMP8 组 5.00±2.97*10 YSHZ 组 16.33±4.18#10总距离（m）7.32±0.99 2.34±1.50*5.62±0.67*#

2.2.2 高架十字迷宫结果 经单因素方差分析发现：与SAMR1组小鼠相比，SAMP8组和YSHZ组小鼠在开放臂停留时间的占比均显著减少（P＜0.05），但与SAMP8组相比，YSHZ组小鼠在开放臂停留时间的占比无统计学差异（P＞0.05）。见表5。

表5 各组小鼠高架十字迷宫结果比较（±s）

表5 各组小鼠高架十字迷宫结果比较（±s）

注：与 SAMR1 组比较，*P＜0.05。

分组 n 开放臂停留时间比例/%SAMR1 组 10 51.54±20.19 SAMP8 组 10 9.88±5.82*YSHZ 组 10 18.12±0.31*

3 讨论

AD属祖国医学“健忘”“痴呆”等病证范畴[10]，其根本病机在于肾虚，兼有痰瘀浊邪[11]，因此采用益肾化浊法以切中肯綮。该法由著名中医脑病专家张伯礼院士提出，课题组成员在传承其经验及研究成果的基础上，结合多年的临床实践和专家建议，以法组方并进行了优化。益肾化浊方由6味中药组成，方中女贞子并制首乌以增滋肾阴之功，淫羊藿合肉苁蓉以强温肾阳之力，4药合用以于“阴中求阳，阳中求阴”；石菖蒲豁痰开窍、川芎活血行气，使津液得布、气血通利。美国国立老化研究所和阿尔茨海默病协会强调AD的病理改变在其临床症状出现前15～20年就已经开始，因此早期干预对于预防或延缓其进一步发展具有重要意义。

快速老化小鼠（SAM）[12]是日本ToshioTakeda教授在京都大学研发，并由天津中医药大学第一附属医院的韩景献教授引进入我国[13]，其中SAMP8小鼠是目前公认的研究衰老和AD的动物模型[14]。随着月龄的增加，雄性SAMP8小鼠不仅行为活动减少、反应下降，外观上皮肤毛发欠光泽、晦暗、粗糙，并出现脱毛、皮肤溃疡、眼睛损害和脊柱后凸的老化征象及情绪失调、昼夜节律紊乱等[15-16]，且伴增龄性学习记忆能力障碍[17]。研究显示，SAMP8小鼠4月龄出现早期学习和记忆障碍[18]，5月龄时已出现焦虑抑郁相关的精神行为异常[19]。而中医认为衰老的出现与肾虚密切相关[20]，故SAMP8小鼠是进行本研究的理想模型。

行为学评价是衡量动物学习记忆能力及其精神行为的主要标准[21]。Morris水迷宫是评价动物学习记忆的经典方法[22]，利用动物厌恶水而被迫游泳、学习寻找水中隐藏平台的本能进行检测。涉及两大经典实验：一是定向航行实验，主要用于考察动物的空间学习记忆能力，其中，动物找到隐匿平台所需的时间为逃避潜伏期，该时间的长短与实验动物的学习记忆能力成反比；二是空间探索实验，主要反映动物对空间记忆的维持能力[23]。旷场实验和高架十字迷宫则是研究动物精神行为的常用测试，前者用于分析小鼠活动和焦虑样行为[24]，小鼠受到压力时在旷场中的活动减少，而其焦虑程度较低时更倾向于在旷场的中央区域活动；后者利用啮齿动物对保护区域如封闭臂的偏好及探索新环境的天性之间的矛盾来考察其焦虑状态，在开放臂中停留时间越长显示其焦虑程度较低。

本次研究结果显示，Morris水迷宫实验中各组小鼠在游泳速度无显著差异的前提下，与SAMR1组小鼠相比，SAMP8组小鼠逃避潜伏期时间明显增加，表现出一定的学习记忆障碍；在空间探索实验中，与SAMR1组相比，SAMP8组小鼠的穿越平台次数显著减少，说明该小鼠对于前5d的学习记忆保持较差；而经过益肾化浊方干预后，SAMP8小鼠逃避潜伏期时间明显缩短，穿越平台次数也显著增加，提示益肾化浊方能有效改善SAMP8小鼠早期学习记忆能力减退。旷场实验和高架十字迷宫结果显示，与SAMR1组相比，SAMP8组小鼠总运动距离、进入中心区域次数及在开放臂停留的时间比例显著减少，提示SAMP8小鼠的精神行为异常；在使用益肾化浊方干预后，SAMP8小鼠总运动距离和进入中心区域次数均显著增加，在开放臂停留的时间比例有增加的趋势，但尚未达到统计学差异，表明益肾化浊方具有一定的抗焦虑作用，考虑进一步扩大实验样本量予以确认。

综上所述，益肾化浊方可有效改善SAMP8小鼠早期学习记忆能力减退及精神行为异常，今后将进行具体机制的探索。