基于Nrf2通路研究二仙解毒方对弱精子症大鼠精子微环境的影响*

李河桥，刘绍明，孙樱菲，张修举

（1.北京中医药大学第三附属医院泌尿外科，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院泌尿男科，北京 100163；3.中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091）

精子生成是一系列细胞事件，与睾丸精子生成或睾丸后成熟有关的分子事件的干扰可能导致不孕不育。根据世界卫生组织的数据，全球近1.9亿人患有不孕不育，其中因男性因素所致者占到半数[1]。各种条件可以不同程度地影响男性的生殖潜力，它们往往共存[2]。越来越多的证据表明，氧化应激（OS）在男性不孕症病因学中起着独立的作用，其中超过半数的男性，基质活性氧物种水平表达过多[3]。OS可以通过多种途径对生育产生负面影响，包括电容干扰和精子细胞膜、DNA可能受损，这可能损害精子受精卵并发育成健康胚胎的潜力[4-5]。然而，精子拥有发达的抗氧化防御网络，包括抗氧化基因和酶，在保护精子的活力和生存能力方面发挥着至关重要的作用。抗氧化基因Nrf2（核因子红细胞2+相关因子2）促进抗氧化酶表达，是抗氧化系统的重要组成部分[6]。本团队前期临床研究发现[7-8]，二仙解毒方以补肾益精、活血解毒为组方思想，可以提高精液质量、精子的活动力（progressive and non-progressive，PR+NP），调整氧化应激状态。为了明确二仙解毒方对弱精子症（asthenospermia，AS）大鼠睾丸及附睾组织Nrf2蛋白表达的影响，本研究通过建立AS大鼠模型，对此进行研究，以进一步阐述为二仙解毒方的临床起效作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级SD健康雄性大鼠72只，8周，体质量 200～250 g，统一购于斯贝福（北京）实验科技有限公司。

1.2 药物 二仙解毒方：熟地黄15 g，牡丹皮9 g，丹参 9 g，枸杞子 12 g，茯苓 9 g，车前子 9 g，仙茅 9 g，淫羊藿9 g，菟丝子12 g，黄精9 g，巴戟天12 g，萆薢9 g，白花蛇舌草15 g，蒲公英12 g，配方颗粒购自北京康仁堂药业有限公司。

左卡尼汀口服液：国药准字H19990372，东北制药集团沈阳第一制药有限公司，规格：10mL；奥立泰：国药准字H20031257，西安万隆制药股份有限公司，规格：0.25 g。

1.3 主要及试剂 EPS 300电泳仪（biorad）；低温离心机（Sigma，德国）；LEGEND MICRO 21R 台式高速冷冻离心机（THERMO）；荧光定量PCR仪（Applied biosystems（USA））；分光光度计（THERMO）；TRIZOL（10296028，Invitrogen）；SuperScript III RT 逆转录 kit（11752050，ABI-invitrogen）；Sybr qpcr mix（4472920，ABI-invitrogen）；DJ-1（ab18257，Abcam）。

1.4 方法 采用随机数字表法将大鼠随机分为空白组、模型组、二仙解毒方低剂量组、中剂量组、高剂量组、左卡尼汀组，每组各12只。除空白组外，剩下各个实验组采取奥硝唑法制备AS模型[9]。二仙解毒方各组均以二仙解毒方浓缩液生药予以灌胃，其中二仙解毒方低剂量组灌胃剂量为7.5 g生药/kg；中剂量组灌胃剂量为15 g生药/kg；高剂量组灌胃剂量为生药30 g/kg；左卡尼汀组灌胃剂量为左卡尼汀口服液0.1 g/kg；空白组、模型组：予生理盐水10 mL/kg体重灌胃。各组灌胃持续4周。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠精子活动力检测 末次给药24 h后处死大鼠，分离睾丸、附睾，取左侧睾丸和附睾置于37℃生理盐水的平皿中，称重后将附睾横切分为大致均匀的上下两部分，将左侧上半部分剪碎的附睾组织移入孵育缓冲液试管中。自大鼠输精管及附睾中留取精液标本，进一步行精子活力检测。

1.5.2 精液氧化应激指标检测 取左侧下半部分睾丸、附睾组织，分别用4℃的生理盐水在冰水浴中制成10%的组织匀浆，离心速度为3 000 r/min，持续10 min，收集上清液并冷冻保存，各小组蛋白表达将采用分光光度法进行。SOD检测用黄嘌呤氧化法；选用硫代巴比妥法来进行MDA检测；考马斯亮蓝法被用来检测GSH-Px；采用荧光探针测定精子ROS；具体步骤说明书实施。

1.5.3 Western Blot检测睾丸、附睾组织Nrf2蛋白的表达 从-80℃冰箱中取出样品，蛋白上样量为20 μg，进行电泳后将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上室温封闭 2 h；以 Nrf2抗体（兔源，1∶5 000）为第一抗体，HRP-山羊抗兔IgG（1：6 000稀释）为第二抗体进行孵育；漂洗后加入发光液，显影、定影。用Quantity One对蛋白条带的灰度进行定量，以β肌动蛋白为内参，计算相对表达量用来统计学分析。

1.5.4 RT-PCR检测睾丸、附睾组织Nrf2基因的转录取另一侧大鼠睾丸组织，用RNA simple Total试剂盒提取总RNA，用Rever TraAce qPCR RT kit试剂盒反转录成cDNA，设计目的基因及管家基因引物，以cDNA为模板，采用 SYBR Green进行PCR检测。同时测定待测样品的管家基因（β-actin）及目的基因Ct值和对照组管家基因（β-actin）及目的基因Ct值，其中数据相对定量分析，将通过2－△△CT法计算。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差（±s）来表示；满足正态分布的数据选择单因素方差分析来实现多个小组之间的比较。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 精子密度及活动力比较 对比空白组与模型组大鼠精子浓度，结果表明不存在统计学差异（P＞0.05），而PR+NP精子百分率下降，存在统计学差异（P＜0.01），说明AS大鼠成功造模。与模型组比较，二仙解毒方低剂量组精子密度升高（P＜0.05）；其余各组精子密度显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，二仙解毒方低、中、高剂量组、左卡尼汀组中精子活动力PR+NP精子均上升，有显著统计学差异（P＜0.01）。见表2。

表2 不同浓度二仙解毒方对大鼠精子的改变（±s）

表2 不同浓度二仙解毒方对大鼠精子的改变（±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

组别 数量 精子密度/（×106·L-1）PR+NP/%空白组 12 39.17±4.62** 60.23±1.72**模型组 12 15.06±4.17 41.06±1.19二仙解毒方低剂量组 12 19.94±2* 45.51±1.52**二仙解毒方中剂量组 12 22.83±4.65** 49.43±0.77**二仙解毒方高剂量组 12 31.30±4.04** 62.31±1.12**左卡尼汀组 12 33.16±3.96** 57.21±0.85**

2.2 不同浓度二仙解毒方对大鼠精液氧化应激指标的影响 与正常组比较，模型组SOD、GSH-Px水平显著降低（P＜0.01），MDA、ROS水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各组SOD、GSH-Px含量明显上升（P＜0.01），MDA、ROS含量明显下降（P＜0.01），且二仙解毒方剂量越高，氧化应激指标改变越显著。此外，二仙解毒方高剂量组大鼠氧化应激指标与空白组相比，二者未表现出统计学差异（P＞0.05），提示二仙解毒方高剂量组可将模型组大鼠的精液抗氧化能力恢复至正常大鼠水平。见图1。

图1 不同浓度二仙解毒方对大鼠精液氧化应激指标的影响（±s）

2.3 二仙解毒方对大鼠附睾、睾丸Nrf2 mRNA表达的影响 在附睾组织中，与模型组比较，空白组，二仙解毒方低、中、高剂量组Nrf2 mRNA的表达都显著上升（P＜0.01），左卡尼汀组中 Nrf2 mRNA 同样上升（P＜0.05）。睾丸组织中，各组Nrf2 mRNA表达均显著提高，具有一定的统计学差异（P＜0.01）。见表3。

表3 二仙解毒方对大鼠附睾、睾丸组织Nrf2 mRNA表达的影响

2.4 二仙解毒方对大鼠附睾、睾丸组织Nrf2蛋白表达的影响 附睾组织中，与空白组相比较，模型组大鼠Nrf2蛋白表达明显降低（P＜0.05），表明弱精子症大鼠Nrf2蛋白受影响。除左卡尼汀组（P＞0.05）外，各组Nrf2蛋白表达均有所上升，有一定的统计学差异（P＜0.05），说明西药治疗弱精子症的主要靶点不在Nrf2蛋白上；其中高剂量组与空白组比较，结果显示不存在统计学差异（P＞0.05），说明二仙解毒方高剂量组效果最好，能在实验层面恢复大鼠Nrf2蛋白表达。睾丸组织中，相对于模型组，二仙解毒方中剂量组蛋白表达较高，且有一定的统计学差异（P＜0.05）；空白组和高剂量组蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；二仙解毒方低剂量组和左卡尼汀组Nrf2蛋白表达无明显变化。提示在恢复蛋白表达上，二仙解毒方效果明显，左卡尼汀无显著效果。见图2。

图2 不同浓度二仙解毒方对大鼠附睾睾丸组织Nrf2蛋白表达的影响

3 讨论

弱精子症临床常见，降低了怀孕几率，影响胚胎质量。专家共识指出，脾肾两虚夹瘀为弱精子症缠绵难愈的关键病机，故治疗要以健脾益肾、活血养精为基本治法[10]。尤在泾《金匮要略心典》载：“毒，邪气蕴结不解之谓”[11]。目前一些高辐射、物理化学性等有害成分可归于中医之“毒邪”。毒邪无所出路，日久蕴积体内，损伤精室，进一步致使精子活力下降。因此，弱精子症不仅有脾肾不足的“本虚”，也有血瘀和毒素积聚过多的“标实”[12-13]。二仙解毒方是由张景岳“赞育丹”化裁所成，在原方基础上加入活血之牡丹皮、丹参，祛湿之茯苓、车前子、萆薢，白花蛇舌草、蒲公英清热解毒。全方不仅补肾之阴阳，而且兼顾瘀血、毒邪。研究表明，淫羊藿、巴戟天可以调节下丘脑-垂体-性腺轴，菟丝子配伍枸杞子可以改善雷公藤多苷导致的精子异常[14-15]。丹参水提物能促进小鼠睾丸生精功能的恢复，减少精子DNA损伤[16]，是治疗弱精子症的有效药物。通过实验研究也已证明，健脾益肾活血解毒法可以增加睾丸组织清除活性氧、抵抗氧化损伤的能力，提升精子生存状态，促使精子运动力上升[17-19]。据了解，世界人口约15%受不育症的影响[20]，其中超过25%的男性不孕症病例是特发性的，没有可识别的原因[21]。氧化应激（OS）和活性氧物种（ROS）被认为对精子有害，占不孕症病例的30%～80%[22]。OS对男性群体的生育力和精子功能造成了较大的伤害。Nrf2可以维持细胞内的氧化平衡，降低细胞对死亡信号的敏感性，在细胞抵抗外源性或内源性氧化应激的机制中起重要作用。在Nrf2缺乏的小鼠中，精子浓度和运动能力将受到损害[23]。此外，有证据表明，与受孕男性精子中的Nrf2表达相比，男性不育者精子的Nrf2表达水平较低[24]。因此，Nrf2作为一种抗氧化基因，通过抑制氧化应激来维持精子动物的运动性非常重要[25]。

本实验研究结果表明，二仙解毒方能显著提高精子活动力，能改变氧化应激指标MDA、GSH-Px、SOD、ROS，改善弱精子症大鼠氧化应激状态，有助于恢复氧化与抗氧化的“动态平衡”。二仙解毒方能增加大鼠睾丸和附睾中Nrf2基因的表达。服用二仙解毒方后，大鼠睾丸、附睾组织中Nrf2蛋白表达显著提高，提示二仙解毒方改善精子活力可能与Nrf2通路激活有关。

此外，本实验观察到，二仙解毒方高剂量组在改善氧化应激状态及提高Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白表达效果显著，多数指标恢复到空白组大鼠水平，表明二仙解毒方确有提高精子活动力、改善精子微环境的作用，使之有恢复至正常水平的可能性。二仙解毒方可以减少甚至逆转奥硝唑诱导睾丸和附睾的病理损伤；二仙解毒方高剂量组疗效优于左卡尼汀，体现出中医药治疗疾病的优势之处，但由于少弱精子症病理机制较为复杂，二仙解毒方是否可通过调控其他蛋白及通路来改善精子微环境功能，尚有待于进一步研究。