基于网络药理学探讨益气凉血生肌方预防冠心病PCI术后复发心绞痛机制*

鲁婷婷，龙 佳，汪吴娇，杨志飞，林 谦，万 洁

（1.北京中医药大学 北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一种严重影响居民健康，甚至引起死亡的疾病。全球每年约有740万患者死于CHD[1]。经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）因能够快速有效地开通血管恢复血运而降低冠心病病死率，被广泛地运用于临床。但随着PCI术的普及，其导致的不良影响也逐渐显现出来。临床发现PCI术后患者靶血管常出现内皮细胞受损、炎症反应及血栓形成等病理变化，进而引发复发心绞痛等术后不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）[2-3]。尽管患者在术后接受规律口服药物治疗，其复发心绞痛的概率仍可高达30%，而至于那些对口服药物存在不可耐受的副作用以及严格禁忌证的患者，再发心绞痛概率可能会更高[3-4]。

基于对创伤修复理论的认识，针对PCI术后患者病理变化特点，首都国医名师廖家桢教授创立了益气凉血生肌方（YQLXSJF）用于PCI术后 MACE的临床防治。课题组前期临床研究表明PCI术后早期口服中药YQLXSJF能够有效减少心绞痛的复发[5]。本研究结合课题组前期成果，进一步运用网络药理学，拟通过筛选心绞痛与益气凉血生肌方的共同靶基因，找到YQLXSJF防治CHD PCI术后复发心绞痛的可能机制，为YQLXSJF对PCI术后患者的临床应用以及后续科学研究提供一定基础。

1 资料与方法

1.1 药物靶点筛选 YQLXSJF各味药成分及相应靶点通过中药系统药理学数据库与分析平台[6]（TCMSP）检索，并限定两个ADME属性值：类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 与口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[7-8]。并在 Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）获取标准基因名。

1.2 药物活性成分与靶点图构建 通过cytoscape 3.7.1做出YQLXSJF“活性成分-靶点”图，并在图中用“节点”对二者进行表示，用“边”表示二者关系，并通过“Network Analyzer”统计分析自由度（degree）等网络拓扑参数，对二者之间的关系进行描述。

1.3 心绞痛相关靶点的筛选 以“angina”为关键词，在 GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org）、OMIM 数据库（https：//mirror.omim.org）中挖掘调治心绞痛的靶点，并在Uniprot数据库中转化成标准的基因名，合并2个数据库靶点后建立疾病的靶标库。在Genecards数据库中，可根据Score＞中位数为筛选标准筛选疾病靶点[9]，删除重复值后得到心绞痛相关靶点。

1.4 药物和疾病共同靶点筛选 通过微生信在线平台（http：//www.Bioinforma-tics.com.cn/）将 YQLXSJF化学成分靶点和心绞痛相关的疾病靶点进行映射，绘制Venn图，获得交集靶点。

1.5 蛋白质互作网络（PPI）构建和关键靶点筛选运用 STRING11.0 数据库（https：//www.string-db.org/）把将交集靶点提交至形成PPI网络[10-11]，设置最小相互作用阈值为“highest confidence（0.700）”，选择人类并对断开的节点进行隐藏，将下载的tsv导入Cytoscape 3.7.1进行PPI作图。采用CytoNCA插件，根据接近（Closeness Centrality，CC）、介数（Betweenness Centrality，BC）中心性以及自由度（Degree，DC）3 个主要参数进行拓扑筛选[12]，得到其核心靶点。

1.6 生物学功能和通路分析 使用Metoscape平台[13]对核心靶点进行基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本体（GO）分析，并通过微生信在线平台对结果进行可视化。

1.7 关键靶点-通路图构建 应用Cytoscape 3.7.1构建核心靶点-信号通路图，并进行网络特征分析，得出YQLXSJF防治心绞痛的关键靶点和通路。

2 结果

2.1 药物成分、靶点的筛选以及图形构建 在TCMSP数据库中共筛选出该方119种化学成分，其中黄芪20种，丹参65种，丹皮11种，金银花23种；去除未查到靶点的成分，去重后共得到44种候选药效成分（表1）。得到2 116个相关靶点，去重后有252个。各味药物的成分与各成分对应靶点构成的网络图中共包括节点285个和相互关系735个（图1）。

表1 YQLXSJF成分信息

续表1

图1 YQLXSJF活性成分-靶点网络图

2.2 心绞痛靶点的获取及交集靶点PPI构建GeneCards与OMIM数据库得到的心绞痛靶点取并集，得到疾病靶点1 740个。疾病与药物靶点取交集获得166个共同作用靶点，此即YQLXSJF预防心绞痛有重要意义的靶点（图2）。在STRING数据平台输入166个共同靶点，设置完成后下载Tsv文件，并导入到Cytoscape 3.7.1中得到一个由161个节点和1 415条边组成的网络（图3A）。以DC、BC和CC中位数为筛选标准，取同时大于以上3个指标中位数的靶点作为第1次筛选结果，图中共有节点55个和相互关系677个（图3B）；第2次以大于2倍DC的中位数作为筛选标准，进一步筛选，得到257个相互作用和26个节点，将这些靶标作为YQLXSJF作用于心绞痛的核心靶点（图3C）。26个核心靶点依次为：AKT1、TP53、MAPK8、IL6、MAPK1、TNF、VEGFA、JUN、STAT3、EGF、EGFR、CXCL8、MYC、MMP9、IL1B、CASP3、RELA、CCND1、FOS、PTGS2、APP、CCL2、ESR1、MAPK14、ICAM1、IL10（表2）。

图2 心绞痛疾病靶点与YQLXSJF活性成分靶点韦恩图

图3 共同靶点PPI网络图

表2 YQLXSJF预防心绞痛核心靶点

2.3 核心靶点GO分析 在Metoscape数据库中对药物活性成分与疾病的26个共同核心靶标进行GO富集分析，得到分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）以及细胞组分（Cellular Component，CC）的富集结果，如图4所示BP方面，共同作用靶点在炎症反应（inflammatory response）、DNA结合转录因子活性的调节（regulation of DNA-binding transcription factor activity）等较多；在CC方面，主要富集在膜微结构域（membrane microdomain）、膜筏（membrane raft）等；在 MF 方面，主要富集在转录因子结合（transcription factor binding）、信号受体激活因子的活性（signaling receptor activator activity）等。

图4 富集GO term BP，CC，MF三合一柱状图

2.4 KEGG通路富集分析 在Metoscape数据库中对药物活性成分与疾病的26个共同靶标进行KEGG通路富集分析，选取Pvalue排名前20的通路进行可视化分析，得到KEGG通路富集分析图（图5）。共同靶点集中在糖尿病并发症AGE-RAGE（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF（TNF signaling pathway）、IL-17 （IL-17 signaling pathway）以及流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）等，提示 YQLXSJF 作用于以上多条通路来预防PCI术后心绞痛的发生。

图5 KEGG通路富集分析图

2.5 关键靶点-通路网络的构建 在KEGG分析中，将核心基因集中较多的通路和这些基因进行可视化分析（图6）。基因用正方形表示，信号通路v形表示。共41个节点，221个相互关系。并进行特征分析，Degree值大小通过图形大小表示。结果表明Degree值最大的为 RELA；其他如 MAPK14、MAPK1、MAPK8、TNF、IL1B、FOS、AKT1、IL6 等基因也具有较大的Degree值。这些靶基因可能是YQLXSJF预防心绞痛的核心靶标。

图6 核心靶点-通路图

3 讨论

PCI是一把双刃剑，一方面在缓解临床症状的同时，另一方面也会引起血管损伤，短时间内导致平滑肌细胞快速增生迁移以及血栓形成，进而导致术后心绞痛等MACE的出现[14]。因此，在血管内膜创伤修复时，维持冠状动脉血管稳态，对减少PCI术后再发心绞痛等MACE的发生具有重大意义。首都国医名师廖家桢教授在中医创伤修复理论的基础之上结合临床实践，拟定益气凉血生肌方YQLXSJF（黄芪、丹皮、丹参、金银花）用于临床，该方已获得国家专利（ZL200810240175.4）。方中黄芪益气托毒生肌，丹皮、丹参合用凉血活血、祛瘀生新，金银花凉血祛瘀，重视补益正气兼顾清除热瘀之邪。前期临床研究发现YQLXSJF降低PCI术后患者再狭窄率的趋势、减少术后复发心绞痛等MACE的发生率[5]，改善远期预后[15-16]。进一步在基础实验中发现YQLXSJF对球囊损伤术后兔颈动脉具有促进修复的作用，对VEC的增殖具有促进作用，同时能抑制VSMC的增殖和迁移，使血管内皮功能得以改善[17]。但PCI术后复发心绞痛的单独作用机理缺乏整体阐述。本研究使用网络药理学方法整体分析YQLXSJF抗心绞痛的主要作用机制。

本研究通过在TCMSP数据库初步筛选出候选药效成分及靶点，再进一步借助软件对YQLXSJF成分靶点信息进行网络分析，从网络图中得到关键的药效成分，其中山柰酚、槲皮素与木犀草素等黄酮类化合物Degree值排名靠前。YQLXSJF中大多数化合物会影响多个靶标。根据Degree值排名靠前的有山柰酚、槲皮素以及木犀草素等，这3种化合物率属于黄酮类化合物，大量研究表明黄酮类化合物能够清除体内过多的自由基并拮抗血小板活化因子，从而抑制VSMC增殖以及血管壁增厚[18]。一项大样本临床研究表明食用富含山柰酚、槲皮素以及木犀草素能够明显降低冠心病心绞痛的发生以及冠心病致死率[19]。山柰酚、槲皮素以及木犀草素调节了与心绞痛疾病相关的大多数靶标，均具有抑制VSMC增殖，且OB较高，因此，推测它们可能为YQLXSJF的代表性化合物。

YQLXSJF与心绞痛蛋白质相互作用核心网络图结果显示，该方防治心绞痛的靶点主要集中在AKT1、TP53、MAPK8、IL6、MAPK1、TNF、VEGFA、JUN以及FOS等。AKT1主要是参与调节机的体炎症反应、免疫调节以及新陈代谢等过程，为冠心病患者的重要的生物标记物及治疗靶点[20]。MAPK1与MAPK8能够参与调节细胞凋亡及炎症等多种细胞反应[21]。JUN与FOS属于两种原癌基因，能够调控IL-6、IL-1β的表达以及机体的炎症反应。此外，研究表明Jun-Fos核蛋白复合物在心肌缺血、心肌梗死以及PCI术后管腔再狭窄等心血管疾病病理过程中起到重要作用[22]。学者刘婧玮等研究发现IL6与TNF在冠心病血瘀证患者中存在高表达，这也佐证了YQLXSJF能够用于冠心病PCI术后证型为血瘀的患者[23]。因此，推测这些靶点基因主要能够通过调节炎症反应、免疫、新陈代谢来预防冠心病心绞痛。

为进一步探讨YQLXSJF潜在作用机制，KEGG分析结果发现的多条潜在信号通路中，流体剪切应力与动脉粥样硬化，TNF、IL-17以及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路相关性大。剪切应力是血流在血管壁内皮表面产生的摩擦力，在血管生物学中起着核心作用，并有助于心绞痛的发展。扰动的血流和相关的往复运动以及低剪切应力通常会上调内皮细胞基因和蛋白的表达，从而促进动脉壁的氧化和炎症状态，促进硬化斑块的化生，最后发生心绞痛[24]。AGERAGE信号传导涉及MAPKs以及蛋白激酶C的多个细胞内信号途径的激活，然后影响NF-κB活性[25]。NF-κB可促进促炎因子（如IL-6和TNF-α）以及与心绞痛相关的基因VEGF表达。而VEGF能加快血管形成[26]。推测YQLXSJF可能通过以上等通路发挥防治PCI术后心绞痛的作用，前期对PCI术后复发心绞痛机制的研究与本研究结果基本一致[27-29]。除此之外，富集分析结果显示YQLXSJF作用于心绞痛与炎症反应、膜筏、转录因子结合等生物过程相关。未来可以从PCI术后剪切应力和炎症反应等通路方面对凉血生肌方预防冠心病PCI术后复发心绞痛机制进一步验证。

本研究运用网络药理学方法初步探究YQLXSJF预防冠心病PCI术后再发心绞痛的潜在作用机制，为YQLXSJF防治PCI术后复发心绞痛的临床应用以及后续科学研究提供一定理论基础。但由于网络药理学研究热点的倾向性和数据库信息完整性和准确性的限制，且药物成分及其相应靶点数量有限，不能完全阐述中药复方的药理作用，且中药从口服到代谢过程中，要经历复杂的过程，故需后续代谢组学研究明确入血成分。为明确该方作用于心绞痛的主要靶点，仍需进一步细胞实验验证。