木霉菌对黄瓜生理特性及立枯病防治效果的影响

马光恕，梁 枭，李 梅，刘明鑫，陈玉蓉，廉 华*

（1.黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，大庆 163319；2.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

黄瓜（CucumissativusL.）又名胡瓜，葫芦科，是一种世界性的蔬菜经济作物，有重要的生产和经济价值[1]。随着黄瓜种植面积的扩大、复种指数的提高，土传病害的发生和危害日益加重。立枯丝核菌（Rizoctoniasolani，简称Rs）等病原菌可侵染黄瓜发生立枯病，造成幼苗生长迟缓或迅速死亡[2]，是一种重要的黄瓜苗期土传病害。目前主要采用种子和床土消毒等物理法，或用多菌灵、代森锰锌、恶霉灵、甲霜灵等化学农药来防治黄瓜立枯病，存在病原菌抗药性增强、农药残留、土壤环境恶化等诸多问题和风险[3]。利用拮抗微生物防治黄瓜立枯病，有利于黄瓜的安全生产，并日益受到关注。

木霉菌Trichodermaspp.是广泛应用的植病生防真菌，对多种植物病原真菌，特别是土传病原真菌有较好的拮抗作用[4]，同时，木霉菌还是重要的植物促生菌（plant growth-promoting fungi，PGPF），不仅促进植物的生长发育，还能够改善植物生理代谢等功能[5-7]。不同的木霉菌种和菌株，对植物病害的防病机制、防病效果和适应性存在较大的差异[8]。木霉能产生多种具有抗菌活性的次级代谢产物，并较多地溶解于发酵液中，因此，木霉发酵液更利于促进植物生长，并提高对病害的防治效果[9]。如深绿木霉T.atroviride发酵液的稀释液促进了山新杨幼苗SOD（超氧化物歧化酶，superoxide dismutase）、POD（过氧化物酶，peroxidase）、CAT（过氧化氢酶，catalase）、PAL（苯丙氨酸解氨酶，phenylalanine ammonialyase）和PPO（多酚氧化酶，polyphenoloxidase）等防御酶活性的提高[10]。而不同稀释倍数的深绿木霉T.atroviride发酵液对黑麦草幼苗具有明显的促生作用，提高了幼苗的株高、根系的长度、鲜重、干重和根冠比，显著提高幼苗叶绿素、可溶性蛋白含量和PPO、POD和PAL等酶的活性[11]。

利用生防木霉菌防治 Rs引起的立枯病已有较多的研究报道[12,13]，如绿色木霉对西瓜有显著的促生效果，处理后植株的株高、茎粗、地上部质量、根冠比、壮苗指数等均显著高于对照[14]。利用深绿木霉 T95、哈茨木霉SQR-T37等防治黄瓜立枯病均取得了较好的效果[15,16]，能够明显增加黄瓜叶片中的叶绿素a、叶绿素b含量，叶片净光合速率也稳定在相对高的水平[17]。但目前关于木霉菌处理对黄瓜的生长特性、生理生化特性、防病效果的影响尚缺乏系统研究。本研究采用前期筛选出的对黄瓜立枯病菌 Rs具有较强拮抗效果的3株木霉菌，系统研究了木霉菌处理对黄瓜的生长及生理特性的影响，以及对黄瓜立枯病的防治效果，为揭示木霉菌与植物的互作机制，推动木霉菌的开发应用提供依据，为黄瓜优质、安全、高产栽培提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试黄瓜品种：“长春密刺”购于山东新泰市裕园种业有限公司。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2。马铃薯葡萄糖液体培养基（PD）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2。

供试菌株：棘孢木霉Trichodermaasperellum437、哈茨木霉T.harzianum670和752，由中国农业科学院植物保护研究所木霉研究组提供。

立枯丝核菌Rhizoctoniasolani（Rs），由中国农业科学院植物保护研究所土传病害生物防治研究组提供。

供试基质材料：试验中所使用的基质材料是草炭和蛭石的混合物，草炭:蛭石（体积比）=2:1（基质基本农化性状如下：pH 6.92，有机质34.5%，碱解氮760 mg/kg，速效磷53 mg/kg，速效钾157 mg/kg）。基质过筛（1 mm）后于烘箱中160 ℃高温灭菌2 h，自然冷却后继续在160 ℃烘2 h后放凉备用[18]。

1.2 木霉发酵液和立枯丝核菌菌丝悬浮液的制备

木霉发酵液的制备：将木霉菌株670、752、437分别接种于PDA平板，于28 ℃活化培养3 d。从菌落边缘取直径5 mm的菌饼，转接到含有100 mL PD液体培养基的 250 mL三角瓶中，于28 ℃、250 r/min振荡培养 3 d，双层纱布过滤去除菌丝，制成木霉发酵液。用血球计数板测定孢子数，并将木霉发酵液的孢子数调整到1.5×108孢子/mL备用[18]。

立枯丝核菌菌丝悬浮液的制备：将病原菌Rs在PDA培养基上28 ℃黑暗条件培养3 d，从菌落边缘取直径5 mm的菌饼5块，接种在含有100 mL PD的250 mL三角瓶中，28 ℃、250 r/min振荡培养3 d，用双层纱布滤出菌丝团，将菌丝搅碎，用无菌水调整浓度为1.1×107CFU/mL的菌丝悬浮液，备用。

1.3 盆栽试验方法

1.3.1 试验设计 黄瓜育苗在黑龙江八一农垦大学农学院教学基地的日光温室内进行。将灭菌基质材料装入塑料材质的育苗盘（34.5 cm×24 cm×11 cm），每个育苗盘播入120粒催芽后的黄瓜种子。播种后浇无菌水，保证黄瓜正常出苗和生长。出苗后，根据苗势保留大小一致的小苗50株。在第一片真叶展开时（播种后5 d），用木霉发酵液和Rs菌丝悬浮液进行灌根处理，每个育苗盘用量为150 mL，即保证黄瓜单株接种量为3 mL。试验共设9个处理，每个处理3盘，随机区组设计，5次重复。处理如下：① 接种木霉437（T437）；② 接种木霉670（T670）；③ 接种木霉752（T752）；④ 复合接种木霉437和Rs（T437B）；⑤ 复合接种木霉670和Rs（T670B）；⑥ 复合接种木霉752和Rs（T752B）；⑦ 多菌灵 800倍液与 Rs处理作为化学对照（CB）；⑧ 接种 Rs为病原菌对照（B）；⑨ 接种无菌PD培养液为对照（P）。

1.3.2 试验测定指标与方法 播种后12 d，分别测定黄瓜的抗病性指标、生长指标和生理指标。每个处理选30株苗，用于抗病性指标测定，抗病性指标包括植株发病率、病情指数、防治效果；每个处理选5株苗用于测定幼苗生长指标；选15 株苗用于测定生理指标。检测指标和方法如下：

株高：茎基部到生长点之间的距离，用直尺测定；茎粗：子叶节下1 cm处粗度，用游标卡尺测定；根体积：采用排水法[19]；叶面积采用称重法，即用叶片打孔器（1.5～2.0 cm）取一定面积（A1）的叶片，将它与其余的叶片分别烘干，求出打孔取样的干叶重量（W1）和叶片其余部分的干叶重（W2），即可求出该叶片的面积（A），A=A1/W1×（W1＋W2）；植株鲜重：植株用清水反复冲洗后，用吸水纸吸干，用1/1000电子天平测定鲜重。

叶绿素含量，采用丙酮乙醇法[20]；根系活力，采用α—萘胺氧化法[21]；叶片硝酸还原酶活性，采用活体分光光度法[22]；根系总吸收面积，采用甲烯蓝法[23]。

叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用氮蓝四唑法[24]；叶片过氧化物酶（POD）活性，采用愈创木酚比色法[25]；叶片过氧化氢酶（CAT）活性，采用高锰酸钾滴定法[26]；叶片多酚氧化酶（PPO）活性，采用滴定法[27]。

黄瓜苗期枯萎病参照方中达[28]的分级标准，病情指数参照宗兆锋和康振生[29]的计算方法。0级：无症状；1级：茎基部有小病斑，占茎围的1/4以下；2级：茎基部的病斑较大，约占茎围的1/4～1/2之间；3级：茎基部的病斑占茎围的1/2以上，但尚未破坏整个茎围；4级：茎基部的病斑占据全部茎围，植株死亡。植株发病率为播种后12 d各处理发病株数占调查总株数的百分比。病情指数= ∑（病级株数×代表级数）/（植株总数×最高代表级值）×100。防治效果（%）=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.4 田间试验方法

1.4.1 试验设计 田间试验在黑龙江八一农垦大学农学院试验基地塑料大棚内进行，土壤类型为黑钙土。每亩施用有机肥5000 kg、磷酸二氢铵50 kg，土壤充分耕翻，设置高畦，下畦宽120 cm、上畦宽100 cm，畦高13～15 cm，畦长5 m。高畦定植2 行，株距25 cm，行距60 cm，一个栽培畦设置为一个试验小区，小区面积为12 m2。试验共设4个处理，每个处理3个试验小区，随机区组设计，5次重复。当幼苗长到4叶1心（播种后30 d）时，选取长势一致的健壮苗定植于大棚内。每个小区栽植黄瓜42 株。缓苗（定植后3 d）后分别以木霉437（T437）、670（T670）和752（T752）的发酵液灌根处理，每株100 mL，对照灌无菌PD培养液（CK）。缓苗后及时吊蔓，单蔓整枝，每3 d浇水一次。

1.4.2 试验测定指标与方法 在黄瓜果实采摘中期，各试验小区随机选取 20 个果实，测定品质指标。可溶性固形物含量采用日本爱宕 PAL-1 型便携式手持折光仪测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[30]；Vc含量采用紫外分光光度法[31]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250 染色法[32]。每个试验小区随机选取10个果实，测定平均单瓜重。跟踪测定各小区产量，按照小区面积折算为亩产量。

1.5 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2007软件进行图表制作，试验数据取3次重复的平均值和标准差，利用DPS 7.05（data processing system）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 木霉对黄瓜幼苗形态和生物量积累的影响

经木霉437、670和752处理的黄瓜幼苗株高、茎粗、叶面积、根体积、全株鲜重均显著高于对照P，说明3株木霉菌对黄瓜幼苗的生长均具有显著的促进作用，其中以T670的促进作用最强，T437居中，T752较弱。T670处理的黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶面积、根体积和全株鲜重分别比对照增加了53.48%、19.80%、32.47%、26.00%和54.43%。病原菌与木霉菌或多菌灵同时接种，即T437B、T670B、T752B、CB处理，其幼苗的相应生长指标均显著高于病原菌对照B，其中以木霉670对病原菌的抑制和对黄瓜的促生作用最强，T670B处理的黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶面积、根体积和全株鲜重分别比B增加了42.14%、20.14%、27.47%、72.73%和66.42%（表1）。

表1 木霉菌对黄瓜幼苗形态和生物量积累的影响Table 1 Effect of Trichoderma on the morphology and biomass accumulation of cucumber seedlings

2.2 木霉对黄瓜幼苗生理特性的影响

2.2.1 木霉对黄瓜幼苗叶绿素含量和硝酸还原酶活性的影响 3个木霉菌处理（T437、T670、T752）的黄瓜幼苗叶绿素含量均显著高于P处理，T670处理叶绿素含量最高，T670与T437、T437与T752之间差异均不显著，说明木霉菌处理可以不同程度地提高幼苗叶绿素含量。病原菌Rs处理（B）的叶绿素含量最低，病原菌与木霉菌或多菌灵同时施用（T437B、T670B、T752B、CB）的叶绿素含量均显著高于B处理，T670B处理叶绿素含量显著高于其他处理，其中以T670B处理的叶绿素含量最高（图1）。

木霉菌处理均不同程度地提高了幼苗叶片硝酸还原酶活性，其中 T670的促进作用显著高于 T437和T752，且T437和T752的差异不显著。B处理的硝酸还原酶活性最低，显示病原菌不利于黄瓜对氮素营养的利用；木霉菌或多菌灵与病原菌同时施用（T437B、T670B、T752B、CB）时，黄瓜叶片的硝酸还原酶活性均显著高于B，表明木霉菌或多菌灵减弱了病原菌对黄瓜氮素利用的抑制作用（图1）。

图1 木霉菌对黄瓜幼苗叶绿素含量和叶片硝酸还原酶活性的影响Fig.1 Effect of Trichoderma on chlorophyll content and leaf nitrate reductase activity of cucumber seedlings

2.2.2 木霉对黄瓜幼苗根系活力和根系总吸收面积的影响 木霉菌处理（T437、T670、T752）可以不同程度地提高幼苗根系活力和根系总吸收面积，其中T670与T437之间差异不显著但均显著高于T752；B处理的根系活力和根系总吸收面积最低；病原菌与木霉菌或多菌灵同时施用（T437B、T670B、T752B、CB）处理的根系活力和根系总吸收面积均显著高于B，表明施用木霉菌或多菌灵有利于提高幼苗根系活性，减弱病原菌对幼苗根系活性的抑制作用（图2）。

图2 木霉菌对黄瓜幼苗根系活力和根系总吸收面积的影响Fig.2 Effect of Trichoderma on root activity and total root absorption area of cucumber seedlings

综上检测结果，3株木霉菌处理对黄瓜幼苗的叶绿素含量、叶片硝酸还原酶活性、根系活力、根系总吸收面积均都有显著的促进作用，并以木霉670的促进作用最强，播种后12 d，T670处理的黄瓜幼苗的叶绿素含量、叶片硝酸还原酶活性、根系活力、根系总吸收面积分别比P增加了43.55%、51.52%、28.42%、17.31%；复合接种中，以T670B的促进作用最强，T670B处理黄瓜幼苗的叶绿素含量、叶片硝酸还原酶活性、根系活力和根系总吸收面积分别比B增加了68.82%、45.06%、64.44%和21.38%（图1，2）。

2.2.3 木霉对黄瓜幼苗保护性酶活性的影响 3株木霉菌处理均不同程度地提高了幼苗叶片SOD和POD活性，其中T670对提高SOD和POD活性的促进作用最大。处理B的SOD和POD活性最低；病原菌与木霉菌或多菌灵同时施用（T437B、T670B、T752B、CB）处理的SOD、POD活性均显著高于处理B，其中T670B处理的SOD活性显著高于其他含有病原菌的处理，T437B、T670B和T752B处理POD活性差异不显著，但显著高于处理CB（图3）。

图3 木霉菌对黄瓜幼苗超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的影响Fig.3 Effect of Trichoderma on superoxide dismutase activity and peroxidase activity of cucumber seedlings

3株木霉菌均不同程度地提高了幼苗叶片CAT和PPO活性，其中以T670处理的促进作用最大。B处理的CAT和PPO活性最低，病原菌与木霉菌或多菌灵同时施用（T437B、T670B、T752B、CB）的黄瓜叶片中两种酶活性均显著高于B，T670B与T752B、T752B与T437B之间差异均不显著，CB处理的两种酶活性显著低于T437B、T670B、T752B（图4）。

图4 木霉菌对黄瓜幼苗过氧化氢酶和多酚氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of Trichoderma on catalase activity and polyphenol oxidase activity of cucumber seedlings

综上结果，3株木霉菌处理对黄瓜幼苗叶片的SOD、POD、CAT、PPO活性均有显著的促进作用，以木霉670的促进作用最强，播种12 d时，T670处理的黄瓜幼苗的SOD、POD、CAT、PPO活性分别比P增加了74.06%、92.91%、57.04%、87.38%；复合接种中以T670B处理的促进作用最强，T670B处理的黄瓜幼苗SOD、POD、CAT、PPO活性分别比B增加了93.64%、101.60%、40.50%、53.00%（图3，4）。

2.3 木霉对黄瓜枯萎病盆栽防治效果的影响

单独病原菌处理（B）的发病率和病情指数显著高于 Rs与木霉菌（T437B、T670B、T752B）及多菌灵（CB）的组合处理，T437B、T670B、T752B的防治效果分别为76.63%、76.87%和75.18%，三者的差异不显著，但均显著高于CB的防治效果53.25%（表2）。

表2 木霉菌对黄瓜立枯病防效的影响Table 2 Effect of the control efficiency of Trichoderma against cucumber R.solani

2.4 木霉对黄瓜产量和品质的影响

3株木霉菌不同程度的提高了黄瓜的单瓜重和亩产量，并改善了黄瓜品质。木霉菌处理（T437、T670、T752）的黄瓜果实的可溶性固形物、可溶性糖、Vc、可溶性蛋白含量均显著高于CK。其中T670处理效果最好，黄瓜单瓜重、亩产量、可溶性固形物含量、可溶性糖含量、Vc含量和可溶性蛋白含量分别比CK增加了22.12%、22.08%、31.25%、24.40%、160.00%和23.72%（表3）。

表3 木霉菌对黄瓜产量和品质的影响Table 3 Effect of Trichoderma on yield and quality of cucumber

3 讨论

立枯丝核菌是一种全球性以危害葫芦科、茄科和禾本科等作物为主的土传病原真菌，由 Rs引起的植物立枯病经常造成大面积缺苗和毁灭性的损失[33]，筛选高效广谱的木霉菌株并采用合理的施用方法对有效防治立枯病具有重要意义[34]。本研究的盆栽试验显示，棘孢木霉437、哈茨木霉670和752对黄瓜立枯病的盆栽防治效果均达到75%以上，进一步证明这3株木霉菌具有良好的应用潜力。

木霉菌不仅能够防治植物病害，还具有促进植物生长、增强植物生理特性等功能[35]。张春秋等[36]利用拮抗木霉菌防治由尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum引起的黄瓜根腐病，表明拮抗木霉菌能够显著提高黄瓜幼苗生理活性、促进幼苗生长，其中拟康氏木霉T.pseudokoningii886处理的黄瓜幼苗的株高、茎粗和全株鲜重与对照相比分别提高了28.8%、35.1%、10.70%；谷祖敏等[37]研究发现，绿色木霉T.virideTV菌株促进了黄瓜的生长，黄瓜地上部分和地下部分鲜质量分别增加了42.81%和86.92%。本研究中的3株木霉菌处理均可显著提高黄瓜幼苗形态建成和物质积累，并且不同木霉菌之间存在差异，其中以哈茨木霉 670对黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶面积、根体积和全株鲜重促进效果最明显，分别比对照（P，无菌PD培养液）增加了53.48%、19.80%、32.47%、26.00%和54.43%；株高、茎粗和全株鲜重增加幅度均高于张春秋等[36]研究结果，全株鲜重略低于谷祖敏等[37]报道的对应指标，可能与木霉菌株、黄瓜品种、检测时间以及植株生长环境的差异有关。而只接种病原菌 Rs幼苗的株高、茎粗、叶面积、根体积、全株鲜重最低，说明病原菌不利于幼苗的生长，木霉菌和多菌灵均对病原菌有较强的抑制作用，因此在与病原菌同时施用时，木霉菌或多菌灵能够减弱病原菌对黄瓜幼苗生长的抑制作用。

植物抗氧化酶活性如SOD、POD、CAT、PPO等与植物抗病性的强弱存在正相关关系。木霉菌能够诱导植物抗病相关防御酶活性提高，增强植物体的抗病防御能力[38]。宋玉娟[39]利用棘孢木霉T-6孢子悬浮液处理土壤后，烟草体内SOD、POD、CAT酶活性显著提高，酶活性达到峰值时分别比对照增加27.52%、47.26%和46.78%；李聪[40]利用哈茨木霉 TH 发酵液的5倍稀释液处理芦笋，提高了芦笋苗根部SOD、POD、CAT、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性，增加幅度分别为对照的5.89、2.32、3.12、5.21和1.22倍。本研究采用木霉菌或多菌灵处理黄瓜幼苗，黄瓜叶片中SOD、POD、CAT、PPO活性均显著高于只接种Rs 的对照处理，其中以复合接种木霉670和Rs的促进作用最强，说明不同木霉对黄瓜叶片保护作用存在差异，哈茨木霉670强于棘孢木霉437和哈茨木霉752，木霉处理对黄瓜的保护作用强于多菌灵。

张春秋等[36]利用棘孢木霉525、哈茨木霉610和拟康氏木霉886处理黄瓜，3株木霉均可以提高黄瓜幼苗生理指标，黄瓜叶绿素含量、硝酸还原酶活性、根系活力、根系总吸收面积增加幅度分别达到38.7%～49.5%、29.5%～66.3%、10.8%～21.5%、19.6%～23.5%。叶绿素含量反映了植物光合作用的强弱，硝酸还原酶的活性直接影响植物体对氮素营养的利用效果，根系活力和根系总吸收面积是反映根系活性强弱的重要指标，这4个指标均会对黄瓜品质和产量产生一定的影响。本研究的3株木霉菌处理对黄瓜幼苗的叶绿素含量、叶片硝酸还原酶活性、根系活力、根系总吸收面积均有显著的促进作用，单独接种中以木霉 670的促进作用最强，而复合接种中以T670B的促进作用最强。同时，不同木霉菌处理的黄瓜产量和品质之间也存在差异，与其对生理指标的促进作用相吻合。

木霉能产生一系列具有抗菌活性的次级代谢产物，并较多地存在于发酵液中。本研究利用木霉发酵液代替孢子悬液，显著提高了黄瓜幼苗叶片的SOD、POD、CAT和PPO酶活性，提高了黄瓜生理活性，进而提高了对立枯病的抗性，与前人研究结果[15,16]相似，对于发酵液中的哪些代谢产物起作用，有待进一步研究。