提升Bt和球孢白僵菌防治蛴螬效果的颗粒载体

刘 琪，耿丽丽，刘春琴，王庆雷，张 杰，柏 锡，束长龙*

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.沧州市农林科学院，沧州 061001）

蛴螬是鞘翅目Coleoptera金龟总科Scarabaeoedea幼虫的统称，按食性可分为植食性、粪食性和腐食性3类，其中植食性以鳃金龟科Melolonthidae和丽金龟科Rutelidae的一些种类为主[1]，其幼虫为害作物地下部分，成虫取食作物地上部分，并返回土壤中产卵。我国为害作物的蛴螬种类主要有暗黑鳃金龟Holotrichia parallela、大黑鳃金龟Holotrichiaoblita和铜绿丽金龟AnomalacorpulentaMotschulsky[2]，大黑鳃金龟2年发生1代，暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟1年分别发生1代；大黑鳃金龟幼虫期一般在330～450 d、暗黑鳃金龟幼虫期一般在300～330 d、铜绿丽金龟幼虫期一般在300～330 d，因此蛴螬在花生、大豆等作物的整个生育期都会发生为害；蛴螬成虫不集中产卵，并且产卵地点也不固定，这些生物学特性使得蛴螬防治极为困难。花生田遭到蛴螬为害后，轻则减产20%左右，重则减产60%～70%，甚至颗粒无收[3,4]。目前，蛴螬防治的主要手段是在作物根部施用化学农药，截止到2020年2月，国内登记的防治蛴螬的351个农药产品中化学农药占350个（http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml），而生物农药只有1个（球孢白僵菌可湿性粉剂PD20102133，江西天人生态股份有限公司）[5]。

微生物杀虫剂具有安全无毒、无残留和对环境友好等优点[6,7]。目前，国内围绕防治蛴螬的微生物杀虫剂已经开展了深入的研究，分离评估了大量的微生物菌株，其中效果较好的有苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）[8-12]、球孢白僵菌（Beauveriabassiana，Bb）[13,14]、绿僵菌Metarhiziumspecies等[15,16]，然而登记防治蛴螬的微生物产品却很少，原因在于在实际应用过程中，生防微生物有着诸如在土壤环境中适应能力较弱、持效期较短和速效性普遍低于化学农药等问题，并且很难准确把握害虫的防治时期，导致防治效果不理想。这些问题阻碍了相关生物杀虫剂的推广应用。对生防微生物来说，目前缺少一种可以提升防治效果，又可以延长作用时间的有效剂型。与可湿性粉剂相比，农药颗粒剂（Granule）具有可控释放速度、持效期长和使用方便等特点，并且目前我国尚无登记防治蛴螬的微生物颗粒剂型农药，因此研制颗粒剂型的微生物杀虫剂具有广阔的前景和应用价值。

为了提高对地下害虫的防治效果，德国学者Pascal等[17]利用了金针虫对CO2的趋性，开发了一种以印楝素为主要杀虫活性的物质，利用“玉米粉-酵母”发酵释放CO2进行诱杀的颗粒剂，取得了较好的效果。近年来，有研究表明蛴螬对 CO2也存在较强的趋性[18]；此外，本实验室前期研究表明，对蛴螬有效的 Bt菌株（Bt185）可以在花生粕压制的颗粒内增殖生长，正常产生杀虫蛋白，并且菌体在土壤中能够增殖 40倍左右[19]，这些研究结果为进一步研制具有诱杀功能的防治蛴螬的病原微生物颗粒剂型奠定了基础。本研究在实验室前期研究的基础上，进一步研究了适于目前农业机械施用的Bt、白僵菌颗粒载体。具体研究内容包括优化颗粒载体制备工艺与配方，分析颗粒载体增殖生防微生物能力，以及评估颗粒载体对Bt、白僵菌防治蛴螬效果的影响等几个方面，相关研究结果为防治蛴螬的生物农药的研究与应用提供了新思路，对推进蛴螬等地下害虫的绿色防控具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 颗粒载体原料 玉米粉、花生粕和钙基膨润土（400目）等均购自北京冰达生物技术有限公司。

1.1.2 供试病原菌株与昆虫 Bt菌株Bt185-gfp为实验室前期构建[19]，具有卡那霉素抗性，增殖时可表达绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）；Bt185[20]粉剂由本实验室分离、制备、保存；球孢白僵菌粉剂由中国农业科学院植物保护研究所草地害虫研究组惠赠；暗黑鳃金龟幼虫由河北省沧州市农林科学院植物保护研究所提供。

1.1.3 培养基 液体LB培养基、固体LB培养基均购自北京酷来搏科技有限公司；固体PDA培养基购自美国BD公司。

1.1.4 抗生素 卡那霉素购自Amresco公司：水溶液50 mg/mL，配制时过0.22 μm滤膜，过滤除菌，-20 ℃保存，使用时按照1‰比例加入；可溶性两性霉素B购自北京索莱宝科技有限公司：2.5 mg/mL，-20 ℃保存，使用时用去离子无菌水稀释1000倍。

1.1.5 仪器设备 为了快速制备无菌基础颗粒，本研究采用了单螺杆膨化造粒机（模具孔径3 mm），型号为DFM-80，购自河北新星机械厂；为了检测Bt在颗粒剂上增殖情况，本研究采用了奥林巴斯荧光体视显微镜，型号为SZX16。

1.2 颗粒载体的制备、直径和重量的测量及吸水后形态稳定性评估

将玉米粉、花生粕、膨润土按照1:0:0、3:1:0、1:1:0、1:3:0、1:3:2五种配比并分别以15%和20%两种加水量（质量:体积）进行混合，搅拌均匀后经膨化机高温膨化、切制成颗粒；随机分别取30粒颗粒，进行直径和重量测量，计算每种颗粒的直径和重量；将颗粒放在1.4%水琼脂表面上，通过吸水后的形态变化来评估颗粒的形态稳定性，最终筛选确定最佳的颗粒载体配比。

1.3 对蛴螬有效的生防菌株在颗粒载体上增殖情况检测

1.3.1 菌株Bt185在颗粒载体上的活菌增殖情况检测 将菌株Bt185-gfp接种于LB琼脂平板，过夜活化。挑取绿色单克隆，转接于1/2 LB液体培养基，30 ℃、220 r/min恒温培养至芽胞释放。进一步离心收集芽胞，用灭菌水洗涤去除可溶性蛋白，进一步将上述芽胞配制成1.3×105CFU/μL的悬浮液。每个颗粒接种10 μL Bt185-gfp菌液后，置于1.4%的水琼脂表面上，30 ℃恒温培养。利用荧光体视显微镜分别检测在无菌液及接种菌液0、48、96 h后颗粒上的荧光强度，以判断Bt185的增殖情况。

1.3.2 球孢白僵菌在颗粒载体上的生长情况观测 将1 g球孢白僵菌粉剂均匀悬浮于10 mL灭菌水中，每粒颗粒接种10 μL菌液，将颗粒放入灭菌的1.4%水琼脂表面，28 ℃条件培养，观测白僵菌生长情况。

1.4 菌株Bt185与球孢白僵菌间的对峙培养

将球孢白僵菌接种在PDA固体培养基上生长，待生长出分生菌丝与分生孢子后，取直径5 mm的菌块，将其置于直径90 mm的LB固体培养基中心，距离中心25 mm处分别放置3片灭菌直径6 mm圆形滤纸片，分别滴加Bt185菌液（或Bt185-gfp）10 μL，两性霉素B及LB液体培养基各10 μL作为对照，28 ℃培养5 d后检测结果。

1.5 颗粒载体对Bt和球孢白僵菌杀虫活性的影响

1.5.1 Bt悬液的制备 将1 g Bt185粉剂加入50 mL灭菌水中，配制成Bt悬液，放入冰箱4 ℃保存备用。

1.5.2 Bt颗粒剂的制备 将配置好的Bt悬液吸取20 μL，加到一粒颗粒载体表面，制成颗粒载体＋Bt的颗粒剂，现用现制。

1.5.3 Bb悬液的制备 将1 g Bb粉剂加入50 mL灭菌水中，配制成Bb悬液，放入冰箱4 ℃保存备用。

1.5.4 Bb颗粒剂的制备 将配置好的Bb悬液吸取20 μL，加到一粒颗粒载体表面，制成颗粒载体＋Bb的颗粒剂，现用现制。

1.5.5 Bt＋Bb颗粒剂的制备 将配制好的Bt悬液和Bb悬液各吸取10 μL，加到一粒颗粒表面，制成颗粒载体＋Bt＋Bb的颗粒剂，现用现制。

1.5.6 颗粒剂对暗黑鳃金龟幼虫的杀虫活性测定 将马铃薯条（5 mm×5 mm×40 mm）作为饲料放入6孔生测板中，设置5组处理：每孔加入20 μL Bt悬液、每孔加一粒Bt颗粒剂、每孔加入20 μL Bb悬液、每孔加一粒Bb颗粒剂、每孔加一粒Bt＋Bb颗粒剂，分别以每孔加20 μL灭菌水、每孔加含有20 μL灭菌水的颗粒载体作为对照，每个生测孔内上面覆盖含水量20%的土壤，并接入1头健康、个体大小均匀的7～10 d龄暗黑鳃金龟幼虫，每12头试虫为一组，3次重复。在温度为（28±1）℃，光周期为16L:8D，相对湿度70%～80%的人工气候箱中饲养7 d后，分别统计各自活虫数、死虫数，计算校正死亡率，校正死亡率（%）＝（对照存活率―处理存活率）/对照存活率，并利用SPSS 17.0对所得数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 颗粒载体的制备、直径和重量的测量及吸水后形态稳定性

为了筛选出最佳的颗粒载体配方，本研究将玉米粉、花生粕、膨润土设置了5种配比及两种加水量（15%和20%），通过单杆螺旋膨化设备制备成颗粒，并对颗粒的颜色、大小及密度进行了统计。结果显示，玉米粉、花生粕、膨润土的比例不同，膨化后颗粒大小颜色也不相同；随着花生粕含量的增加，颗粒的密度逐渐增加；20%加水量的颗粒略小于15%加水量的颗粒（图1）。

图1 不同营养成分配比的颗粒载体制备及吸水后形态变化Fig.1 Preparation of granular carriers with different proportion of nutrients and morphological change after water absorption

进一步精确测量了不同配方颗粒的直径和重量。结果显示，随着花生粕含量的增多，颗粒的直径和重量均呈现下降的趋势（图2、3）。在目前农业生产中，有专门用于撒播尿素等肥料颗粒产品的机械，因此本研究参照尿素颗粒直径规格（2.0～4.8 mm）进行颗粒载体筛选，结果表明，玉米粉、花生粕、膨润土比例在1:1:0、1:3:0、1:3:2三种颗粒（图1C、D、E）的直径大小符合要求。此外，本研究还测定了不同颗粒载体在吸水条件下的结构稳定性，将颗粒置于水琼脂表面吸胀24 h后进行观测，发现玉米粉含量高的颗粒以及加入膨润土的颗粒没有开裂（图 1A、B、E），并且在颗粒制备过程中发现，20%的加水量挤压膨化出颗粒过程更加流畅，不易损伤机器。综合以上指标分析，最终确定玉米粉、花生粕、膨润土比例为1:3:2，20%加水量为最佳的颗粒载体配比，用于进行下一步研究。

图2 不同营养成分配比的颗粒载体直径测量Fig.2 Measurement of the diameter of granular carriers prepared with different proportion of nutrients

图3 不同营养成分配比的颗粒载体重量测量Fig.3 Measurement of the weight of granular carriers prepared with different proportion of nutrients

2.2 菌株Bt185在颗粒载体上的增殖情况

为了检测Bt菌株在颗粒载体上增殖的情况，本研究利用对暗黑鳃金龟幼虫有效的Bt菌株（Bt185-gfp）进行了增殖测试。结果显示，随着培养时间增加，荧光体视显微镜检测到颗粒载体上荧光逐渐增加；当刚刚接种Bt185-gfp菌液时，观察不到明显的荧光；培养48 h后，观察到明显的荧光；培养到96 h时，荧光强度进一步增加（图4）。上述结果说明Bt可以在本研究制备的颗粒载体上增殖生长。

图4 Bt185-gfp菌株在颗粒载体上的增殖情况荧光检测Fig.4 Fluorescence detection of Bt185-gfp proliferation on granular carrier

2.3 球孢白僵菌在颗粒载体上的生长情况观测

为了检测球孢白僵菌在颗粒上生长情况，本研究将球孢白僵菌悬液接种到颗粒表面，并将颗粒置于水琼脂表面上进行观测。结果表明，球孢白僵菌可以利用颗粒载体营养萌发生长，72 h后菌丝体长至5～10 mm，进一步培养可以形成孢子（图5）。

图5 球孢白僵菌在颗粒载体上的生长情况Fig.5 Growth of B.bassiana on granular carrier

2.4 Bt185与球孢白僵菌间的对峙培养分析

为了评估Bt与球孢白僵菌之间是否存在相互抑制作用，本研究进行了白僵菌与Bt185菌株的对峙培养试验。结果显示，白僵菌的菌丝体从培养基中心向周围扩散生长，Bt185对白僵菌的菌丝无抑制作用，而两性霉素B周围形成了明显的抑菌圈；同时，从培养皿底部可以观察到Bt185正常生长，周围形成菌苔（图6）。上述结果表明，Bt185与球孢白僵菌之间没有拮抗作用，两种生防菌株可以协同使用。

图6 Bt185与球孢白僵菌间的对峙培养Fig.6 Bt185 and B.bassiana by confrontation culture

2.5 颗粒载体对Bt和球孢白僵菌杀虫活性的影响

为了分析颗粒载体对 Bt和球孢白僵菌杀虫效果的影响，本研究测定了Bt185粉剂、Bb粉剂、颗粒载体＋Bt185、颗粒载体＋Bb以及颗粒载体＋Bt185＋Bb五个处理对暗黑鳃金龟7～10日龄幼虫的校正死亡率。结果显示，颗粒载体与Bt185结合后，对暗黑鳃金龟幼虫的校正死亡率由单独使用Bt185粉剂的（25.22±6.07）%提升至（51.47±2.65）%，杀虫效果是粉剂的2倍；颗粒载体与白僵菌结合后，校正死亡率由单独使用白僵菌粉剂的（34.61±6.47）%提升至（64.57±5.04）%，杀虫效果同样提升了近2倍；并且颗粒载体与两种生防菌株联合使用的校正死亡率达（77.55±4.16）%，显著高于Bt185或白僵菌的单一粉剂（图7），上述结果表明颗粒载体能够提升Bt和白僵菌的杀虫效果。

图7 颗粒载体与Bt和球孢白僵菌结合对暗黑鳃金龟幼虫的生物活性影响Fig.7 Effects of the combination of the granular carrier with B.thuringiensis and B.bassiana on the biological activity of the H.parallela larvae

3 讨论

微生物杀虫剂具有环境友好和对靶标生物安全等优点，但是，其目前在蛴螬防控方面存在防治成本高、环境适应性差、持效期短等问题，限制了其应用。本研究研制的可增殖多种对蛴螬有效的生防微生物的颗粒载体，通过增加土壤中杀虫微生物及杀虫蛋白的量，提高杀灭蛴螬的机会。此外，本研究研制的颗粒在吸水条件下有较好的结构强度，使得内部营养可以缓慢释放，可以延长杀虫微生物在土壤中宿存的时间，进一步提高蛴螬防治效果。因此，本研究研制的颗粒载体可以用于降低蛴螬的防治成本、提升防治效果，为蛴螬生物防治提供了新思路。

Bt、白僵菌和绿僵菌等是最常用的生物杀虫剂。Bt通过消化道作用于靶标害虫，Bt产生的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）被取食后，在昆虫肠道中被蛋白酶激活，活化的杀虫蛋白进一步与中肠上皮细胞表面特异性受体结合、形成穿孔、并导致细胞凋亡，Bt与肠道细菌进入血腔，引起败血症，进一步杀灭靶标害虫[21]。白僵菌和绿僵菌的分生孢子直接通过体表作用于靶标昆虫。分生孢子在昆虫体表附着萌发，形成的芽管穿透昆虫表皮进入血腔，菌丝在血腔内不断生长并释放毒素，最终杀灭靶标害虫[22]。因为Bt和白僵菌作用机制不同，两者联合使用可以提高杀虫效果[23,24]。本研究评估了对暗黑鳃金龟有效的Bt与白僵菌菌株，两者没有拮抗作用，并且都可以在颗粒载体上增殖，进一步的杀虫活性测定显示两者协同使用可以显著提升杀虫效果。相关研究结果为蛴螬生防产品的研发与使用提供了参考资料。但本研究只测试了 Bt与白僵菌两种菌株，更多对蛴螬有效的生防微生物能否利用颗粒载体营养增殖生长，以及不同接菌量对杀虫效果的影响，仍然需要进一步的研究。

此外，花生粕是花生仁经榨油后的产物[25]，富含蛋白质与多糖，可用作生产有机肥的原料。有研究表明，花生粕发酵后对植物的生长具有显著的促进作用[26]。本研究中的颗粒载体是以花生粕作为主要原料，搭载生防微生物后施于植物根部附近。有研究表明，生防微生物在增殖过程中分泌的水解酶分解有机质产生的小分子以及代谢形成的化合物可诱导植物抗病、促进植物生长[27]。因此，今后在防治蛴螬等地下害虫过程中，颗粒载体对植物的生长发育是否存在积极的影响具有进一步研究的价值。

综上所述，本研究通过优化工艺与配方，制备了一种可以利用现代农用机械施用、结构稳定、可增殖、对蛴螬有效的生防微生物的颗粒载体，明确了其提升 Bt与白僵菌杀虫活性的作用，相关研究结果对开发蛴螬高效生物杀虫剂提供了新思路，对突破蛴螬生物防治的瓶颈有重要意义。