干旱胁迫下外源亚精胺、甜菜碱对菘蓝种子萌发和幼苗生理特性的影响

韩多红 王恩军 张 勇 王红霞 王 艳 王 富

（1河西学院生命科学与工程学院，734000，甘肃张掖；2甘肃省河西走廊特色资源利用省级重点实验室，734000，甘肃张掖）

菘蓝（Isatis indigotica Fort.）为十字花科（Cruciferae）菘蓝属（Isatis）植物，产于我国江苏、河南、河北、甘肃和黑龙江等地，其干燥根为中药板蓝根，性寒，味苦，具有清热解毒、凉血利咽之功效，主治温毒发斑、发热咽痛、大头瘟疫和臃肿等[1]。板蓝根应用广泛，既是中医临床配伍的常规用药，也是板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒等常用中成药的主要药材原料[2]。对于药用植物来说，干旱是所有自然灾害中危害最大的一种，具有发生频率高、分布面积广、持续时间长及危害性大等特点[3]，它对药用植物的影响大于其他非生物胁迫的总和，影响中药材的品质与资源[4]。近年来，有关多胺和甜菜碱对植物在逆境下的生理调控作用日益受到关注。

亚精胺（Spd）作为多胺中一种具有强烈生理活性的小分子脂肪族含氮碱，对植物生长发育具有多方面的调节作用。外源Spd可通过提高脯氨酸合成代谢关键酶活性，促进脯氨酸和可溶性糖的积累，从而提高保水性和抗旱能力，还可通过抑制NADPH氧化酶活性提高抗氧化酶活力，降低活性氧，提高幼苗的抗旱性[5-6]。甜菜碱（GB）是一种水溶性生物碱，是甘氨酸甜菜碱的简称，广泛存在于植物中，在逆境下，它的积累可以增强植物的抗性[7]。研究表明，外源GB易于被植物叶片或根系吸收，且不易被快速降解[8]，因此通过施加外源GB提高植物抗旱能力是切实可行的。

目前，甘肃省正在大力发展中药材产业，其中菘蓝作为重点种植药材，种植面积已达3万hm2左右。由于甘肃省大部分地区属于干旱半干旱地区，水分亏缺每年都会造成部分药材作物减产甚至死亡等情况。目前有关外源Spd和GB对菘蓝在干旱胁迫下的生理调控作用及其生化响应的研究尚未见报道。本研究通过根施不同浓度的Spd和GB，研究干旱胁迫下两者对菘蓝种子萌发和幼苗抗氧化酶体系的生理响应及其对渗透调节物质含量的影响，探讨缓解干旱胁迫的调节机制，以期为菘蓝的抗旱栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用菘蓝种子由甘肃省张掖市诚泰药业有限责任公司提供，是农业生产中所用的种子，实际为菘蓝的果实，经河西学院张勇教授鉴定为菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥成熟种子。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发指标的测定 选取大小一致饱满的菘蓝种子，在水中浸泡12h后，用5%的NaClO溶液消毒3min，然后用蒸馏水冲洗干净。设置PEG+Spd和PEG+GB的2个处理组（表1），浓度分别为 PEG-6000（10%）+Spd（0、25、50、75、100mg/L）和PEG-6000（10%）+GB（0、10、20、30、40mmol/L），对照（CK）为蒸馏水。采用滤纸发芽床，挑选消毒处理后的种子，分别放入垫有两层滤纸的发芽盒中，分别加各处理液10mL，摆入50粒种子，3次重复，置于恒温培养箱中培养，设定温度25℃，光照时间10h，光照强度2 000lx。每天统计种子萌发数，第3天计算发芽势（GV），第7天计算发芽率（GR）、发芽指数（GI）和活力指数（VI）。GV=3d内正常发芽的种子数/全部供试种子数×100%；GR=7d内正常发芽种子数/全部供试种子数×100%；GI=Σ（Gt/Dt），Gt为浸种后t日的发芽数，Dt为相应发芽日数；VI=S×GI，S为种子平均鲜重。

表1 PEG及外源Spd、GB浓度Table 1 Concentrations of PEG, exogenous Spd, and exogenous GB

1.2.2 幼苗生理指标的测定 选取籽粒大小一致饱满的菘蓝种子，用5%的NaClO溶液消毒3min，用蒸馏水冲洗干净，在25℃的恒温培养箱中浸种催芽，待种子露白后播种于育苗钵内，每钵种植10粒，用1/4的Hoagland培养液浇灌。播种后40d植株长出2片真叶后开始胁迫处理，各处理液浓度见表1，每天每钵早晚各根施5mL处理液，以蒸馏水为对照（CK），处理7d后测定各项生理指标。采用酸性茚三酮显色法测定游离脯氨酸含量[9]；采用TBA法测定丙二醛（MDA）含量[9]；采用TYS-A型叶绿素测定仪测定叶绿素含量（SPAD值）[9]；采用电导仪法测定质膜透性[9]；分别用愈创木酚法、氮蓝四唑（NBT）显色法和紫外吸收法测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性[10]。

1.3 数据处理

用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（oneway ANOVA），用Duncan's新复极差法进行多重比较（P＜0.05），用Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝种子发芽指标的影响

由表2可以看出，在干旱胁迫（GH）处理下，菘蓝种子的GR、GV、GI和VI分别较CK降低了61.29%、54.09%、59.82%和77.39%；在PEG+Spd组合中，从处理GH到T3，种子的各项发芽指标呈不断升高的趋势，在T3时，GR、GV、GI和VI达到干旱胁迫（GH）处理后的最大值，分别比GH处理增加了70.38%、145.49%、108.33%和230.77%；T4处理种子的各项发芽指标下降。在PEG+GB组合中，从处理GH到T3，种子的各项发芽指标呈不断升高的趋势；T3处理GR、GV、GI和VI最大，分别比干旱胁迫（GH）处理增加了75.0%、180.41%、130.56%和269.23%。

表2 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝种子萌发的影响（x+s，n=3）Table 2 Effects of exogenous Spd and GB on seed germination of Isatis indigotica Fort. under drought stress

2.2 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗SPAD值的影响

由图1可见，菘蓝幼苗在干旱胁迫（GH）下的SPAD值比CK降低了34.25%，两处理间存在显著性差异（P＜0.05）。在添加外源Spd和GB后，幼苗中SPAD值在T1至T3处理时逐渐升高，在T3处理时达到最大值，分别增至CK的97.33%和99.36%，与CK间无显著性差异（P＞0.05）；在T4处理（Spd 100mg/L、GB 40mmol/L）时，幼苗中SPAD值大幅下降。

图1 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗SPAD值的影响Fig.1 Effects of exogenous Spd and GB on SPAD value of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.3 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗脯氨酸含量的影响

由图2可见，菘蓝幼苗在干旱胁迫（GH）下 的脯氨酸含量大幅升高，较CK增加了137.64%，两处理间差异显著（P＜0.05）。在添加外源Spd和GB后，幼苗中脯氨酸含量逐渐下降，在T3处理（Spd 75mg/L，GB 30mmol/L）时降至最小值，分别较GH处理降低了48.67%和45.79%，但仍高于CK。在T4（Spd 100mg/L，GB 40mmol/L）处理时，幼苗中脯氨酸含量开始上升。

图2 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗脯氨酸含量的影响Fig.2 Effects of exogenous Spd and GB on proline content of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.4 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗MDA含量的影响

由图3可见，菘蓝幼苗在干旱胁迫（GH）下的MDA含量大幅上升，较CK增加了248.69%。在添加外源Spd和GB后，幼苗中MDA含量在T1～T3处理时明显下降，但在T4处理时上升。添加Spd处理下，T3（75mg/L）处理MDA含量降至最小，较GH处理下降了49.99%；添加GB处理下，T3（30mmol/L）处理MDA含量较GH处理下降了66.18%，且与CK间无显著性差异（P＞0.05）。

图3 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗MDA含量的影响Fig.3 Effects of exogenous Spd and GB on MDA content of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.5 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗质膜相对透性的影响

由图4可见，在干旱胁迫（GH）下，菘蓝幼苗的质膜相对透性升高，较CK升高了85.62%，两处理间差异显著（P＜0.05）。在添加外源Spd和GB处理下，从T1到T3幼苗质膜相对透性逐渐下降，在T3处理（Spd 75mg/L、GB 30mmol/L）降至最低，分别为CK的119.11%和104.23%，且添加GB的T3处理与CK间无显著性差异（P＞0.05）。

图4 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗质膜相对透性的影响Fig.4 Effects of exogenous Spd and GB on relative permeability of plasma membrane of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.6 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗抗氧化酶活性的影响

由图5可见，干旱胁迫（GH）下菘蓝幼苗中SOD活性升高，较CK升高了32.02%，2个处理间存在显著性差异（P＜0.05）；在添加外源Spd和GB后，幼苗中SOD活性均出现先升后降的趋势，在T3时达到最大。在T3处理时，添加Spd处理的SOD活性比GH处理增大127.33%，添加GB的处理增大152.15%。在T4处理（Spd 100mg/L，GB 40mmol/L）时，幼苗SOD活性下降，但均高于GH处理。

图5 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗SOD活性的影响Fig.5 Effects of exogenous Spd and GB on SOD activity of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

由图6可见，干旱胁迫（GH）下菘蓝幼苗中POD活性升高，较CK升高了47.31%；在T1～T3处理下，幼苗POD活性不断升高，在T4处理时下降；在T3处理时，添加Spd处理下的POD活性比GH处理增加了40.32%，添加GB的处理增加了48.90%。在T4（Spd 100mg/L，GB 40mmol/L）处理时，幼苗POD活性明显下降，与GH处理间无显著性差异（P＞0.05）。

图6 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗POD活性的影响Fig.6 Effects of exogenous Spd and GB on POD activity of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

由图7可见，干旱胁迫（GH）下菘蓝幼苗CAT活性提高，较CK升高了19.18%。在T1～T3处理下，幼苗中CAT活性不断升高，GB处理的CAT活性升高幅度大于Spd处理；在T4处理时，幼苗的CAT活性下降。T3处理时，添加Spd的处理CAT活性比GH处理升高29.92%，添加GB的处理增加44.55%。

图7 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗CAT活性的影响Fig.7 Effects of exogenous Spd and GB on CAT activity of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

3 讨论

3.1 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝种子发芽指标的影响

干旱是影响植物生长发育的主要逆境因素，干旱胁迫通过渗透效应影响种子的吸水作用，从而影响发芽[11]。发芽势是表明种子的生活力、发芽整齐度和生产潜力的指标，发芽率是反映种子发芽状态最主要的指标[12]。本研究中，10%的PEG-6000模拟干旱胁迫处理导致菘蓝种子的发芽率等萌发指标明显降低，表明干旱胁迫对其种子萌发有一定的抑制作用，影响了种子萌发的速度、整齐程度和质量。当添加外源Spd（≤75mg/L）和GB（≤30mmol/L）时，种子的各项发芽指标均出现随浓度增大而升高的趋势，T3处理（Spd 75mg/L、GB 30mmol/L）各萌发指标增加的幅度最大。表明外源Spd和GB对菘蓝种子萌发期间的干旱胁迫具有明显的缓解作用，这与张丽等[13]对麻黄种子的研究结果一致。

3.2 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗相关生理指标的影响

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量反映植物叶片光合能力，干旱胁迫对叶绿素含量的影响是造成植物光合作用降低的重要原因[14]。本研究中，干旱胁迫使菘蓝幼苗中叶绿素含量下降，但在添加外源Spd（≤75mg/L）和GB（≤30mmol/L）后，SPAD值上升，说明外源Spd和GB能够调节菘蓝幼苗在干旱胁迫下的叶绿素含量，这与李丽杰等[15]对玉米和李冬等[16]对烤烟的研究结论一致。植株在逆境下积累的渗透调节物质越多，则表示其抗旱调节的能力越强[17]。本研究中，干旱胁迫下的脯氨酸含量大幅增加，在添加Spd和GB后，脯氨酸含量逐渐下降，但仍然高于对照，说明外源Spd和GB能缓解干旱胁迫给植株叶片渗透调节系统所造成的压力，这与尤东玲等[18]对玉米和邹芳等[19]对甜高粱的研究结论一致。

质膜透性和MDA含量是反映细胞膜系统受到伤害程度和膜脂过氧化程度的重要指标[20]。本研究中，干旱胁迫使细胞质膜发生了过氧化作用，诱导MDA含量增加，同时细胞内的各种水溶液外渗，导致相对电导率增大；但在干旱胁迫下添加外源Spd（≤75mg/L）和GB（≤30mmol/L）后，MDA含量出现了降低，说明外源适宜浓度的Spd和GB能够缓解膜脂过氧化反应，降低质膜透性，提高植株抗旱能力。

3.3 外源Spd和GB对干旱胁迫下菘蓝幼苗抗氧化酶系统的影响

植物体内O2-、H2O2和OH–等活性氧自由基在发生干旱时会大量产生，它们启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用，破坏细胞膜结构，植物通过调节SOD、POD和CAT等内源活性氧清除剂进行清除[21]。本研究中，干旱胁迫诱使菘蓝幼苗中POD、SOD和CAT活性均出现了小幅度升高，通过自身调节来缓解一定程度的干旱胁迫伤害；在添加外源Spd和GB后，POD、SOD和CAT活性均出现了先上升后下降的趋势，说明外源Spd和GB能调控幼苗中抗氧化酶系统的活性，大幅度提高抗氧化酶系统清除ROS的能力，增强植株在干旱逆境中的自我保护能力，这与张凤等[22]和王贵平等[7]的研究结论一致，但过高的Spd和GB浓度会造成调控能力减弱。

亚精胺和甜菜碱均广泛存在于植物中，在逆境下，植物体内的亚精胺和甜菜碱含量均会出现明显增加，其抗性也会提高，所以被广泛用在植物抗逆性的研究方面。但适度干旱胁迫可提高药用植物的品质，增加次生代谢产物的积累，而添加外源Spd和GB后，尽管可以有效提高菘蓝的抗旱性，但对其中根部有效成分[(R，S)-告依春]和叶中有效成分（靛玉红）的积累影响如何，还需进行深入研究。在实际的农业生产中，由于甜菜碱的价格相对较低，且易于被植物叶片或根系吸收，所以在大田生产中可采用叶面喷施或灌根的方式使用；亚精胺由于价格昂贵，在大田生产中难以推广使用。

4 结论

干旱胁迫对菘蓝种子的萌发和幼苗的生长均具有一定的抑制作用，但在添加一定浓度的外源Spd和GB后，可促进种子萌发，增强幼苗的渗透调节能力，提高抗氧化酶系统的活性，提高抗氧化酶系统清除ROS能力的阈值。其中，以75mg/L的Spd或30mmol/L的GB对干旱胁迫的缓解效果最佳，可有效提高菘蓝的抗旱性。