气质联用法同时测定皮革及其制品中7种限用异噻唑啉酮类抗菌剂

王成云，冯均利，白爽，孙小颖，李泳涛，李勇，杨左军

(深圳海关工业品检测技术中心，广东 深圳 518067)

皮革及其制品富含蛋白质和油脂，易发生霉变，需进行抗菌防霉整理以提高防霉性能。异噻唑啉酮类抗菌剂是一类高效、广谱抗菌剂，首先由美国Rohm&Haas 公司取得专利权，抗菌机理是抗菌剂分子穿透微生物的细胞壁进入细胞内部，与核酸(RNA 和DNA)中的碱性基结合，抑制微生物的再生繁殖[1,2]。异噻唑啉酮类抗菌剂大量用于皮革及其制品的防霉整理[3-6]。但是，部分异噻唑啉酮具有接触致敏性，长期接触时可导致接触性皮炎、皮肤灼伤、湿疹、哮喘[7-19]。部分异噻唑啉酮类抗菌剂被证明对水生动物具有急性毒性[20-22]，职业性接触时甚至可导致中毒性肝病死亡[23]。因此各国纷纷立法限制其使用[24,25]，2012 年发布欧盟生物杀灭产品法规(Biocidal Products Regulation,BPR)，禁止在皮革中使用2- 甲基 -4- 异噻唑啉 -3- 酮(2-methyl-4-isothiazolinone,MI)、1,2- 苯并异噻唑啉 -3- 酮(1,2-benzisothiazo- lin-3-one,BIT)、5- 氯 -2- 甲基 -4- 异噻唑啉 -3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, CMI)、2-丁基-1,2- 苯并异噻唑啉-3- 酮(2-butyl-1,2- benzisothiazolin-3-one, BBIT)、4,5- 二 氯 -2- 正 辛 基-4- 异噻唑啉-3- 酮 (4,5-dichloro-n-octyl-4- isothiazo-lin-3-one, DCOI)、2- 正辛基 -4- 异噻唑啉-3- 酮(2-n- octyl-4- isothiazolin-3-one, OI)等 6 种异噻唑啉酮类抗菌剂，2013 年 9 月 1 日起，BPR 禁用2- 甲基-1,2- 苯并异噻唑啉-3- 酮(2- methyl-1,2-benzisothiazolin-3-one,MBIT)。皮革中异噻唑啉酮的测定已有文献报道[26-29]，但测试对象只涵盖了部分限用异噻唑啉酮。本文采用超声萃取技术提取皮革及其制品中的异噻唑啉酮类抗菌剂，提取液用固相萃取柱进行净化后进行气质联用分析，建立了1 个能同时测定皮革及其制品中7 种限用异噻唑啉酮类抗菌剂的气质联用分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimazdu GCMS-TQ 8040MX 气质联用仪 (日本Shimazdu 公司)；Retch SM2000 织物研磨仪 (德国Retch 公司)；MJ-600 型超声波清洗机(无锡市美极超声设备有限公司)；RV10 型旋转蒸发仪(广州市华馨科学仪器有限公司)；DCY-12 型氮吹仪(常州市万合仪器制造有限公司)；0.45μ m 聚四氟乙烯滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)；supelclean LC-Ph 固相萃取柱(0.5g/3mL,美国 supelco 公司)。

OI (纯度 99.9%)、BIT (纯度 99.2%)、MI (纯度99.5%)均由美国 Sigma-Aldrich 公司提供；DCOI(纯度99.8%)由日本东京化成株式会社提供；MBIT(纯度 98.0%)、BBIT(纯度 95.0%)、CMI(纯度 99.0%)均由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司提供。色谱纯甲醇由美国Merck 公司提供，用甲醇配制质量浓度约为1000 g/mL 的各标准储备液，移取适量体积的各标准储备液到25 mL 容量瓶中，用甲醇配制成混合标准储备液。混合标准储备液中MI、DCOI、CMI、BIT、MBIT、BBIT、OI 的质量浓度分别为 40.23、39.67、39.20、38.40、20.75、20.49、19.19 g/mL，用甲醇将其分别稀释 2、5、10、20、50、100、200、400 倍，得到系列浓度的混合标准工作液。

阳性样品：市售黑色牛皮革，含有MI 和CMI。

1.2 样品前处理

样品前处理参照文献[28]进行，选取有代表性的样品，切割成小块后，用织物研磨仪粉碎成粉末。准确称取1.0 g 粉末，置于35 mL 玻璃反应瓶中，加入25 mL 甲醇，40℃ 下超声萃取 25 min，过滤，用鸡心瓶收集滤液。将鸡心瓶转移至旋转蒸发仪中，在真空下旋转蒸发至近干。将鸡心瓶转移至氮吹仪中，用干燥氮气缓慢吹干，用2 mL 甲醇溶解残渣。所得溶液转移到已经用5 mL 甲醇进行预活化的supelclean LC-Ph 固相萃取柱(0.5g/3mL)中，用5 mL 甲醇淋洗，收集流出液，控制液体流出速度为2 滴/s。将流出液在旋转蒸发仪中旋转蒸发至近干，用干燥氮气缓慢吹干后，用1 mL 甲醇溶解残留物，所得溶液用0.45μ m 滤膜过滤，供 GC/MS 分析用。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

RXi-5MS(30m× 0.25mm× 0.25μ m)色谱柱，初始温度为90℃，以15℃/min 的速度升至280℃，保持3 min。传输线温度、进样口温度分别为280℃、270℃。不分流进样，进样量为1.0 L。载气为高纯氦气(纯度＞99.999%)，载气流速为1.1 mL/min。溶剂延迟3.0 min。

1.3.2 质谱条件

电离方式为电子轰击电离(EI)，电离能为70eV，四极杆温度和离子源温度分别为150℃、210℃。采用全扫描方式定性，选择离子监测方式(GC/MS-SIM)定量，7 种限用异噻唑啉酮类抗菌剂的特征离子和丰度比见表1。

2 结果与讨论

2.1 净化条件优化

皮革基质复杂，在超声提取目标分析物时，大量伴生杂质也被提取出来，对仪器分析造成干扰，需要先进行净化处理[28，29]。固相萃取柱净化技术是一种常用的净化技术，但经固相萃取柱净化后，往往会损失部分目标分析物，还可能会引入其他杂质。分别考察了 Varian HF Bond C18SPE 柱 (2g/12mL) (1# 柱 )、Supelclean LC-18 SPE 柱 (1g/6mL)(2# 柱)、Supelclean LC-Si SPE 柱 (3g/6mL)(3# 柱)、Supelclean LC-Florisil SPE 柱 (1g/6mL)(4# 柱 )、Agilent Bond Elut C18柱(1g/6mL)(5# 柱)、Agilent Bond Elut Si SPE 柱(1g/6mL)(6# 柱)、Waters Sep-Pak Vac Silica 柱(1g/6mL)(7# 柱)、Anpelclean PA SPE 柱 (1g/6mL)(8# 柱 )、CNW Bond LC-C18SPE 柱 (1g/6mL)(9# 柱)、Supelclean ENVI-18 SPE 柱(0.5g/3mL)(10# 柱)、Agilent Bond Elut Al-N 中性氧化铝柱(1g/6mL)(11# 柱)、Accu Bond Alumina 柱(1g/6mL) (12# 柱 )、Supelclean LC-Ph 柱 (0.5g/3mL)(13# 柱)、Waters Sep-Pak Vac C18柱 (0.5g/3mL)(14#柱)、Varian Bond Elut SCX 柱(0.5g/3mL)(15# 柱)、Accu Bond Florisil PR 柱(0.5g/3mL)(16# 柱)等 16 种固相萃取柱对混合标准储备液的处理效果，表2 给出了经和未经固相萃取柱处理的混合标准储备液色谱峰面积百分比。从表2 可知，经固相萃取柱净化处理后，所有目标分析物均有一定损失，其中经supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)处理时损失最少，7 种目标分析物的回收率均大于95%。比较经16 种固相萃取柱净化处理后的目标分析物的谱图，结果发现，经supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)净化处理后，谱图基线平稳，基本无杂质峰出现。因此，最终选择supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)进行净化。

2.2 超声萃取条件优化

萃取溶剂种类、萃取温度、萃取时间、萃取溶剂体积、萃取方式均对萃取量有影响[30]。以甲醇为萃取溶剂，对阳性样品进行单次超声萃取。首先单独考察萃取温度(因素A)、萃取时间(因素B)、萃取溶剂体积(因素C)对萃取量的影响，结果发现萃取量最大时萃取温度、萃取时间、萃取溶剂体积的值分别为40℃、30 min、25 mL。为考察这3 个因素对萃取量的综合影响，设计了表3 所示的三因素三水平正交实验，在表3 给出的9 个实验条件下对阳性样品进行单次超声萃取。根据表3 的数据计算各因素的k 值和极差[31]，确定优方案，结果见表4。该阳性样品中含有MI 和CMI，对于 MI 和 CMI，其优方案均为 A1B2C1。在此条件下，对该阳性样品连续萃取3 次，测定每次的萃取量。结果发现，第1 次萃取时，萃取量占总萃取量的97%以上，第3 次萃取时，MI 和CMI 均未检出。因此，最终选用单次超声萃取方式。在此条件下选择不同的溶剂进行单次超声萃取，考察MI 和CMI 萃取量的变化情况。皮革及其制品中含有大量脂肪，脂肪易溶于丙酮、正己烷、石油醚、叔丁基甲醚等弱极性溶剂，采用这些溶剂萃取时，萃取产物中夹杂有大量杂质，干扰测试，因此不能使用这些溶剂来萃取。选择极性较强的溶剂对阳性样品进行萃取，结果见表5。从表5 可知，甲醇的萃取量最大。因此，超声萃取条件最终优化为：以25 mL 甲醇为萃取溶剂，40℃下超声萃取25 min。

表1 特征离子及其丰度比

表2 经固相萃取柱净化后的回收率

表3 正交实验

表4 正交实验数据分析

表5 不同溶剂的萃取效果/mg/kg

2.3 分析条件的优化

目标分析物在色谱柱固定相和流动相中的分配系数不同，气相色谱分离时，目标分析物通过在固定相和流动相之间反复分配来实现各组分间的分离，影响分离效果的关键因素是固定相组成，此外，色谱柱长度、固定相厚度也对分离效果有影响。采用RXi-5MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）、DB- 35MS（30m×0.25mm × 0.25μ m）、DB-5HT （15m × 0.25mm ×0.10μ m）、DB-624 （30m× 0.25mm× 4.10μ m）、DB-Wax （60m × 0.25mm × 0.25μ m）、DB-5MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）、DB-5MS（60m× 0.25mm×0.25μ m）、DB-17MS （30m× 0.25mm× 0.25μ m）等8 种常见色谱柱对7 种异噻唑啉酮类抗菌剂混合标准溶液进行分离，改变载气流速、升温程序，观察在不同色谱条件下的分离效果，结果发现，当采用1.3.1 中的色谱条件时，分离效果最好。在此条件下对7 种限用异噻唑啉酮类抗菌剂混合标准溶液进行分析，其GC/MS-SIM图见图1，7 种异噻唑啉酮类抗菌剂之间完全分离，各谱峰峰形尖锐，对称性好。

图1 混合标准溶液的GC/MS-SIM图

2.4 线性关系和检出限

按1.3 给定的分析条件对系列浓度的混合标准工作液进行测试，考察各组分峰面积(A)随其质量浓度(ρ )的变化情况，结果发现，对于每种异噻唑啉酮类抗菌剂，在一定质量浓度(ρ )范围内，其峰面积(A)均与质量浓度(ρ )线性相关，其线性关系见表6。在3倍信噪比 (S/N =3) 的条件下计算方法的检出限，OI、MBIT、BBIT 的检出限均为 0.05 mg/kg，CMI、DCOI、MI、BIT 的检出限均为 0.10 mg/kg。

表6 线性关系和检出限(LOD)

2.5 回收率和精密度

以不含目标分析物的牛皮革作为空白基质，通过添加混合标准溶液来制备3 个不同浓度水平的测试样，每个浓度各制备9 个平行样，按上述方法对各测试样进行测试，确定每个样品中各组分的浓度，计算各组分的平均回收率和相对标准偏差(RSD,n=9)，结果见表7。7 种目标分析物的加标平均回收率为80.21%～95.87%，相对标准偏差(RSD, n=9)为1.26%～4.85%。

表7 回收率和精密度实验

2.6 实际样品测试

采用本文建立的方法对32 个市售皮革和皮革制品样品(羊皮革及其制品样品8 个、牛皮革及其制品样品17 个、猪皮革及其制品样品7 个)进行测试，结果在1 个黑色牛皮革样品中同时检出MI 和CMI，其余31 个样品中则未检出目标分析物。图2是该样品的GC/MS-SIM图，该图中在tR=3.754min、tR=4.152min 处各出现1 个尖锐谱峰，分别对应于MI和 CMI，其含量分别为 1.98、3.55 mg/kg。

图2 1 个阳性样品的GC/MS-SIM图

3 结 论

建立了1 个同时测定皮革及其制品中7 种限用异噻唑啉酮类抗菌剂的气质联用分析方法，该方法采用超声萃取技术提取皮革及其制品中残留的异噻唑啉酮类抗菌剂，提取产物经supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL) 固相萃取柱净化后直接进行GC/MS-SIM测定，外标法定量。该方法检出限为0.05～0.10 mg/kg，远低于相关法规的限量要求。该方法简单快速，灵敏度高，检出限低，可完全满足皮革及其制品中限用异噻唑啉酮类抗菌剂日常检测工作的需要。