硝酸咪康唑阴道软胶囊中、美药典计数方法对比研究

李林樾，李翠，贺聪莹，杨晓莉

(陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065)

硝酸咪康唑[1]，系一种广谱、高效、毒副作用小的咪唑类抗真菌药物，对大多数皮肤癣菌、酵母菌和放线菌等有良好的抗菌作用[2]，还对葡萄球菌、链球菌和炭疽杆菌等革兰阳性菌有抑菌作用[3]。硝酸咪康唑阴道用软胶囊的有效成分是硝酸咪康唑，为白色或微黄色软胶囊，因针对皮肤真菌和酵母菌引起的瘙痒具有迅速的缓解作用而应用普遍。各国药典对外用制剂均要求进行微生物限度检查，且明确在进行微生物限度检查时，应采取不同的前处理方式进行供试液的制备，以达到分散均匀的目的[4]。本品属于油脂类供试品，样品的前处理比较复杂，加之本品的强抑菌型，该品种的微生物计数方法成为试验的难点[5]。本文根据《中国药典》2020年版(四部)通则1105[6]和《美国药典》41版<61>[7]微生物计数方法项下要求的方法适用性试验进行方法验证比较，以求能建立更为科学、实用、简便、高效的硝酸咪康唑阴道软胶囊微生物限度检查方法。

1 设备与试剂、试药

1.1 主要仪器与设备 SX-500蒸汽灭菌器；HFsafe-1200 LC生物安全柜；BS2202S型电子分析天平；LRH-250F生化培养箱；LRH-250F生化培养箱；LRH-250F生化培养箱；IPP260霉菌培养箱；VITEK2全自动微生物鉴定系统；Olympus CH型三目显微镜；PB-10 pH酸度计。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)，上述标准菌株均来自中国医学细菌保藏管理中心，工作用菌株为第3代。

1.3 培养基及试剂 胰酪大豆胨液体培养基(TSB，批号：180820)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA，批号：181217)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA，批号：180108)、沙氏葡萄糖液体培养基(SDB，批号：180731)、pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：180820)均购自北京陆桥技术股份有限公司。Modified Letheen-Broth Base(MLEB，EMD Millipore Corporation，有效期至20230910)；Fluid A(0.1%动物组织胃蛋白酶消化物，青岛宾得生物技术有限公司，批号：20170704)，按说明书配置，灭菌。上述所用培养基的适用性检查均符合药典要求。

1.4 样品 样品编号1：硝酸咪康唑阴道软胶囊，规格：0.4 g，批号：068772，西安杨森制药有限公司生产；样品编号2：硝酸咪康唑阴道软胶囊，规格：0.4 g，批号：200303，南昌百济制药有限公司生产；样品编号3：硝酸咪康唑阴道软胶囊，规格：0.4 g，批号：200605，威海华新药业集团有限公司。

2 实验方法

2.1 菌液制备 将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于TSB中，35 ℃培养24 h；将白色念珠菌接种于SDB中，25 ℃培养3 d。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；将黑曲霉接种于SDA溶液，洗脱孢子，收集孢子悬液，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

2.2 《中国药典》2020年版(四部)通则1105方法进行计数检查适用性试验(以下简称方法一) 根据以往的试验结果，使用《中国药典》2020年版(四部)中规定的中和剂与冲洗液试验，先加入试验菌后冲洗，试验菌的回收率无法达到药典要求，故选择后加菌方式。

2.2.1 供试液制备 无菌取供试品4粒(约11.5 g)，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，转移至无菌均质袋内，用均质器拍击1 min，胶囊壳破裂，内容物释放，制成1∶10供试液。

2.2.2 试验方法

2.2.2.1 试验组 取1∶10供试液10 mL加入含200 mL 1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的输液瓶中，混匀后薄膜过滤，用含1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100 mL/次，在最后一次冲洗液中分别加入不大于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌液。取出滤膜，菌面向上，贴于TSA平板或SDA平板上，按药典规定培养，计数试验组的菌落数。

2.2.2.2 菌液对照组 以pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨-缓冲液代替供试液，同“2.2.2.1”项下操作。

2.2.2.3 样品对照组 不加金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌液，同“2.2.2.1”项下操作。

2.3 《美国药典》41版<61>方法进行计数检查适用性试验(以下简称方法二)

2.3.1 供试液制备 无菌取供试品4粒，加入120 mL已预热的MLEB稀释液中，均质器拍击1 min，胶囊壳破裂，内容物释放，制成1∶10供试液。

2.3.2 试验方法

2.3.2.1 试验组 取1∶10供试液9.9 mL，分别加入不大于1 000 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌液0.1 mL，混匀，全量加入已预热的MLEB稀释液490 mL，制成1∶500供试液。用10 mL Fluid A润膜后，将1∶500供试液500 mL全部薄膜过滤，每张滤膜所过滤的供试液中含菌量不大于100 cfu。用990 mL Fluid A冲洗，100 mL/次。取出滤膜，菌面向上，贴于TSA平板或SDA平板上，按药典规定培养，计数试验组的菌落数。

2.3.2.2 菌液对照组 以MLEB稀释液代替供试液，同“2.3.2.1”项下操作。

2.3.2.3 样品对照组 不加金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌液，同“2.3.2.1”项下操作。

2.4 回收计算 各试验菌回收=(试验组菌落数-供试液对照组菌落数)/菌液组菌落数。分别计算方法一、方法二的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌回收率，若回收率在0.5～2，方法适用性试验通过。

3 结果

需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定各试验菌回收试验结果见表1。各试验菌的回收率均在0.5～2，符合药典要求。

表1 硝酸咪康唑阴道软胶囊微生物计数薄膜过滤法回收试验结果

4 讨论

4.1 供试液制备方法 按照“取样量10 g”的药典要求，本品每粒约重2.90 g，取4粒约11.5 g，基本符合药典取样量要求。方法一中稀释液为100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，这样制得的供试液比例略大于1∶10。若调整称样量精确到10 g，因为软胶囊剂的囊壳不好处理，用灭菌剪刀等处理有造成样品污染的风险；方法二中将4粒样品加入120 mL稀释液中，制得的供试液比例更接近1∶10，试验结果更准确，操作更方便。

4.2 稀释液预热处理 方法一中稀释液未预热，拍击后胶囊壳破碎但不溶解，供试液易冲洗过滤；方法二中稀释液事先预热，拍击过程胶囊壳破碎且溶解，使得样品中的微生物充分与稀释液，冲洗后的滤膜上有少量胶囊壳的白色絮状沉淀物。

4.3 加菌方式 两种方法的加菌方式有所不同。方法一是将1∶10供试液10 mL稀释、薄膜过滤、冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的试验菌；方法二是先取1∶10供试液9.9 mL加入不大于1 000 cfu的菌液0.1 mL，混匀后稀释，再进行薄膜过滤及冲洗，该方法更好地模拟了污染菌与样品的混合，更加符合药典的要求。

4.4 含中和剂的培养基/稀释液的应用 方法一中所用稀释液为含1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，《中国药典》中规定的稀释液和中和剂。聚山梨酯80对抑菌成分具有一定的中和作用，该稀释液需要试验人员自己配制、灭菌；方法二中所用MLEB培养基有预售干粉培养基，未在《中国药典》中载录。该培养基含有卵磷脂0.7 g·mL-1，经验证该冲洗液对试验菌株无抑菌性，同时有效降低药品的抑菌成分，使试验操作简化。使用MELB培养基可应用于具有抑菌性的药物。

5 结语

药品的微生物检验和控制是药品安全性保障的一项重要措施[8]，而供试品的处理是微生物检验的重要环节，是获得较高准确性和良好检验结果的基础[9]。《中国药典》《美国药典》等根据供试品的理化特性与剂型特点，将供试品分为水溶性供试品、水不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品和需用特殊方法制备的供试品等类型，并给出了相应的处理方法。然而，微生物的检验结果经常会受到药物种类、剂型、检验技术等多种因素的影响[10]，尤其是在建立抑菌型强且为油脂类药品的微生物限度检查计数方法时，常因其复杂的基质和强抑菌作用而导致试验菌的回收失败，在严格执行药典要求的基础上，采用常规培养基、稀释液均不能取得较好的回收结果时，可根据药品特性，针对性地建立更方便适宜的个性化检查方法是药品微生物控制鼓励的发展方向[11]。