贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5对烟草赤星病菌的拮抗研究

安依凡 韩猛 姚峰

摘要 从山西运城盐湖泥中采样获得了贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5，为了确定其固体发酵产出的次代菌株是否有效拮抗烟草赤星病菌，进行了贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5的固体发酵，接著使用其次代菌株JW-5-AN和烟草赤星病菌进行平板对峙试验，并建立了一种平板对峙试验描述方法，提出了几个平板对峙试验描述术语，再结合显微检测，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN拮抗烟草赤星病菌，其进攻型拮抗速率为5.56 mm/d，防御型拮抗指数为0.576 0，固体发酵次代菌株JW-5-AN的平板检测结果为5×108CFU/g。这表明贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5具有研发防治烟草赤星病菌微生物菌剂的潜力。

关键词 贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5;烟草赤星病菌;次代菌株JW-5-AN;进攻型拮抗速率;防御型拮抗指数;微生物菌剂

Abstract To determine Bacillus velezensis RJW-5-5s antagonistic ability against tobacco brown spot disease （TBSD） in an elementary level， we processed a lab-level solid fermentation with an outcome of Bacillus strain JW-5-AN， secondary generation of RJW-5-5.The research then conducted an antagonistic experiment with TBSD and Bacillus strain JW-5-AN in a confrontation plate.The research also proposed an alternative way to assess the antagonistic ability of strain JW-5-AN with the conjunction of two timing samples of the confrontation plate experiment by defining some terms as 1-dimensional antagonistic ability， offensive antagonistic velocity， defensive antagonistic quota and 2-dimensional antagonistic ability.The results showed that the antagonistic rate of the offensive strain JW-5-AN was 5.56 mm/d， and the antagonistic index of the defensive strain was 0.576 0. The results of the plate test of the second-generation strain JW-5-AN by solid fermentation was 5×108 CFU/g.Combined with microscopic observation and plate detection， the research concluded that Bacillus velezensis strain RJW-5-5 antagonizes TBSD and the strain had a potential for microbial agent.

Key words Bacillus velezensis RJW-5-5;Tobacco brown spot disease;Secondary strain JW-5-AN;Offensive antagonistic velocity;Defensive antagonistic quota;Microbial agent

烟草赤星病（tobacco brown spot disease）是烤烟生长过程中多发的一种病害。烤烟一旦患上赤星病，叶片上就会出现很多病斑，影响烤烟进行正常的光合作用，阻碍烤烟的健康生长[1]。随着化学农药残留和环境污染问题的日趋严重，在烟草病害防治过程中应减少化学农药的使用。芽孢杆菌是一类产芽孢、革兰氏染色呈阳性的细菌类群，具有较好的生物防治烟草病害的潜力，已成为研发生物防治菌剂的理想对象[2]。笔者研究新发现芽孢杆菌菌株RJW-5-5能否拮抗烟草赤星病菌，以及新发现芽孢杆菌菌株RJW-5-5是否具有研发防治烟草赤星病微生物菌剂的潜力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5。2018年12月，从山西运城盐湖泥中采得土壤样本。经过分离和筛选，一株功能特别、生长力旺盛的菌株RJW-5-5被发现，菌株RJW-5-5的细胞电镜照片见图1。将菌株RJW-5-5交由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心进行鉴定，利用微生物脂肪酸快速鉴定系统（MIDI）进行脂肪酸组成检测，利用Biolog GENⅢ进行生理生化检测，其主要细胞脂肪酸特征和生化代谢特征符合芽孢杆菌（Bacillus）属特征，随后又对其进行分子生物学鉴定，综合鉴定结果显示菌株RJW-5-5为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

1.1.2 次代菌株JW-5-AN。

2005年，Ruiz-García等[3]从西班牙南部马拉加贝莱斯河采集的苦咸水样品中首次分离得到贝莱斯芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌能产生具有广谱抗菌活性的次生代谢产物[4-6]。

为了确定经典固体发酵法能否培育稳定的RJW-5-5次代菌株，进行了菌株RJW-5-5的固体发酵培养，获得其次代菌株JW-5-AN，图2为菌株JW-5-AN的菌落形态。

1.1.3 仪器、工具和培养基。

仪器：立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂;单人垂直送风超净工作台，苏净集团安泰公司;振荡培养箱SPX-250B-D型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;小宝多功能粉碎机XY-600B，永康市小宝电器有限公司;101型电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司;调速多用振荡器HY-4，国华电器有限公司;OLYMPUS CX31光学显微镜等。

工具：玻璃锥形瓶、培养皿、涂布棒、小量筒、试管、打孔器、接种环、离心管、移液枪等。

LB固体培养基：酵母5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15～20 g、无菌水1 000 mL。PDA固体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、无菌水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株选择。

选择贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5的次代菌株JW-5-AN与烟草赤星病菌进行平板对峙试验，以确定贝莱斯芽孢杆菌菌株JW-5-AN是否拮抗烟草赤星病菌，是否具有研发防治烟草赤星病微生物菌剂的潜力。这些菌株的选择承接了西北农林科技大学植物保护学院植物病毒和资源微生物实验室科研团队数以年计的辛勤劳动[7-10]。

1.2.2 次代菌株JW-5-AN的固体发酵与平板检测。

1.2.2.1 菌株活化及液体培养基菌悬液制备。

取保藏于斜面的菌株试管1支，在无菌操作条件下，用接种针挑取斜面菌株，划线法转接至LB固体培养基培养皿内，转接2个培养皿，放入28 ℃恒温培养箱中培养24 h进行菌株活化。制作LB液体培养基500 mL，5 g胰蛋白胨，5 g NaCl，2.5 g酵母浸粉，加入500 mL无菌水中充分溶解，分装至5个锥形瓶中，每个锥形瓶装100 mL。将制作好的液体培养基置于灭菌锅中120 ℃灭菌30 min。在无菌操作条件下，取出活化的菌株培养皿，用接种环挑取适量菌株，将菌株置入锥形瓶LB液体培养基中，重复操作5次，制作5瓶液体培养基种子液。将种子液置于转速180 r/min摇床中培养48 h，即为制备的液体培养基菌悬液。

1.2.2.2 固体发酵培养基的接种和发酵。

将搅拌放置好的固体培养基分装入锥形瓶，200 g一瓶，装13瓶，封口后置于灭菌锅中120 ℃灭菌30 min。将培养好的液体培养基菌悬液和灭菌后的固体培养基置于无菌操作条件下进行接种，按液体和固体1∶10（V/M）比例接种。接种完毕后搅拌，将锥形瓶封口放入28 ℃恒温培养箱中发酵120 h。

1.2.2.3 固体发酵产物的烘干、粉碎与过筛。

取出锥形瓶，如已发酵好，可以看到培养基上长满白色的菌丝，取出发酵好的固体培养基，倒入2个铁瓷盘中，使其分散平铺。然后放入烘箱中烘干，设置烘箱温度50 ℃，烘干48 h。取出烘干的固体发酵物，用粉碎机粉碎，再用毛刷将粉碎后的固体发酵物倒入80目筛子过筛，将过滤好的粉末装入自封袋中，写好标签。

1.2.2.4 平板检测。

取贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN固体发酵粉，称量1 g后置于培养皿中，在超净工作台内，向培养皿加入10 mL无菌水，不断搅拌均匀至固粉充分溶解，此为10-1菌悬液。用移液枪吸取1 mL上述菌悬液打入试管内，用小量杯接取9 mL无菌水后倒入装有菌悬液的试管内，充分振荡试管，此为10-2菌悬液。用移液枪吸取100 μL上述菌悬液打入试管内，用小量杯接取10 mL无菌水后倒入装有菌悬液的试管内，充分振荡试管，此为10-4菌悬液。依次制备10-6菌悬液、10-8菌悬液、10-10菌悬液。用移液枪吸取10-6菌悬液100 μL打入固体LB培养皿中心位置，用洁净的涂布棒将菌悬液均匀涂布，对10-8菌悬液、10-10菌悬液，重复操作，每个梯度涂布2个培养皿。将完成涂布的培养皿封好封口膜，置于恒温培养箱中培养72 h。对3个梯度的培养皿进行观测，皿内菌落数为20～300，则该皿可以用来计数。经平板检测，使用的贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5的固体发酵次代菌株JW-5-AN的活孢子数为5×108 CFU/g。

1.2.3 平板对峙试验初始条件设置。平板对峙试验的初始菌物数量条件，以完全长满PDA培养皿的烟草赤星病菌为原始病菌条件，以一打孔器口径（直径6 mm）为平板对峙试验中烟草赤星病菌的接入量。操作流程：用接种环从JW-5-AN菌株试管中挑取芽孢杆菌，以肉眼可见接种环上载有芽孢杆菌为第一节点;将载有芽孢杆菌的接种环置于盛有100 μL 无菌水的离心管中搅拌，以肉眼可见接种环上的芽孢杆菌全部进入离心管内100 μL无菌水为第二节点;摇匀离心管，制成JW-5-AN芽孢杆菌菌悬液;再用移液枪吸取2 μL 菌悬液作为平板对峙试验菌株JW-5-AN的接入量。

平板对峙试验的初始空间条件，烟草赤星病菌于PDA培养皿的中心位置接入;贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN菌悬液于PDA培养皿直径上，距圆心3 cm处的2点对称位置接入。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN与烟草赤星病菌TBSD的平板对峙试验 为描述贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN對烟草赤星病菌的拮抗能力，从两方面设定评估标准。一是时间标准：从对峙起，以5、12 d为平板采样观测点，简称5 d样本和12 d样本。二是空间标准：5 d样本中，烟草赤星病菌的最大长度、最小宽度、抑制直径;12 d样本中，烟草赤星病菌的最大长度、最小宽度、抑制直径、边沿远端距离。

2.1.1 平板对峙5 d样本及分析。

经过观察及测量，贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN与烟草赤星病菌的平板对峙5 d样本数据：烟草赤星病菌5 d最大长度56.9 mm，烟草赤星病菌5 d最小宽度29.1 mm，贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌的5 d抑制直径为烟草赤星病菌5 d最大长度减去烟草赤星病菌5 d最小宽度，为27.8 mm。

定义贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌的一维拮抗能力值A1等于5 d抑制直径，为27.8;定义贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌的进攻型拮抗速率VAo等于5 d抑制直径除以5，为27.8/5=5.56 mm/d（图3）。

2.1.2 平板对峙12 d样本及分析。

经过观察、测量及计算，贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN与烟草赤星病菌的平板对峙12 d样本数据：烟草赤星病菌12 d最大长度84.2 mm;烟草赤星病菌12 d最小宽度30.0 mm;边沿远端距离一50.0 mm;边沿远端距离二47.0 mm;边沿远端距离平均值为48.5 mm。

由12 d样本，定义贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌的二维拮抗能力值A2等于边沿远端距离平均值，为48.5 mm。定义贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌的防御型拮抗指数QAd等于边沿远端距离平均值除以烟草赤星病菌12 d最大长度，为48.5/84.2=0.576 0（图4）。

2.1.3 定义数值A1、VAo、A2、QAd。对于定义数值，一维拮抗能力A1、进攻型拮抗速率VAo、二维拮抗能力A2、防御型拮抗指数QAd的解释：在第一观测时间点即5 d样本中，近似认为只存在一个方向D1（垂直于病菌生长的长边方向）上的拮抗即一维拮抗，此時芽孢杆菌对于病菌的拮抗表现为进攻型拮抗，定义进攻型拮抗速率VAo，是为了找到一个可能的数据指标来描述芽孢杆菌对病菌的杀菌速率;在第二观测时间点即12 d样本中，存在另一个方向D2（水平于病菌生长的长边方向）上的拮抗即二维拮抗，此时芽孢杆菌对于病菌的拮抗表现为防御型拮抗，定义防御型拮抗指数QAd，是为了找到一个可能的数据指标来描述芽孢杆菌对病菌的占位稳定性。综上所述，贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌的一维拮抗能力值为27.8，进攻型拮抗速率值为5.56，二维拮抗能力值为48.5，防御型拮抗指数值为0.576 0。

2.2 平板对峙试验中烟草赤星病菌样本的显微检测

为了进一步证实菌株JW-5-AN对烟草赤星病菌具有拮抗作用，在400倍光学显微镜下进行检测，对比了平板对峙试验培养皿内，烟草赤星病菌生长范围中，对峙最远处和最近处的烟草赤星病菌生长状况。观测照片见图5、6。

对比图5、6可以看出，与贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对峙最近处的烟草赤星病菌，相较于贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对峙最远处的烟草赤星病菌，出现颜色变深、膨大、断裂现象。由此推断，贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN对烟草赤星病菌有杀菌作用。

3 结论与讨论

该研究初步判断贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5拮抗烟草赤星病菌。同时，该研究建立了一种新的描述方法，即对照平板对峙试验的5、12 d联合样本，定义5 d抑制直径、12 d边沿远端距离平均值等平板对峙试验参数，由此计算芽孢杆菌对于病菌的一维拮抗能力、进攻型拮抗速率、防御型拮抗指数、二维拮抗能力指标，以此增加平板对峙试验的评价角度。

此外，该研究使用贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5的固体发酵次代菌株JW-5-AN与烟草赤星病菌进行平板对峙试验，经过固体发酵，菌株JW-5-AN生长稳定且经过平板检测，活菌数达5×108CFU/g。

该研究初步判断贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5具有研发防治烟草赤星病微生物菌剂的潜力。

参考文献

[1]郭映秀，陈德凤.烤烟赤星病的发生规律及防治对策分析[J].种子科技，2020，38（11）：90，93.

[2]马志远.烟草赤星病菌拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及应用研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.

[3]RUIZ-GARCA C，BJAR V，MARTNEZ-CHECA F，et al.Bacillus velezensis sp.nov.， a surfactant-producing bacterium isolated from the river Vélez in Málaga， southern Spain[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2005，55（Pt 1）：191-195.

[4]李姝江，梁漫，朱天辉，等.杂交竹梢枯病拮抗菌的筛选及抗菌蛋白分析[J].南京林业大学学报（自然科学版），2013，37（6）：27-32.

[5]徐婷，朱天辉，李姝江，等.贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YB15β-葡聚糖酶的抑菌作用与基因克隆[J].中国生物防治学报，2014，30（2）：276-281.

[6]HUANG L，LI Q C，HOU Y，et al.Bacillus velezensis strain HYEB5-6 as a potential biocontrol agent against anthracnose on Euonymus japonicus[J].Biocontrol science and technology，2017，27（5）：636-653.

[7]冯志珍，陈太春，段军娜，等.烟草黑胫病拮抗根际芽胞杆菌FB-16的筛选鉴定及其抑菌活性[J].植物保护学报，2012，39（3）：224-230.

[8]刘伟，刘鹏，沈小英，等.烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2014，42（2）：123-130.

[9]安德荣.植物病毒化学防治的研究现状和所面临的问题[J].生命科学，1994，6（2）：15-18.

[10]安德荣.陕西省烟草病毒病的发生、流行成因及防治技术[J].中国烟草科学，2002，23（1）：46-48.