活血荣络方调节自噬治疗阿尔茨海默病的分子机制研究*

陈瑶，杨仁义，傅馨莹，周德生，宋洋

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208

阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）是一种以记忆力下降、行为改变及认知功能障碍为主要表现的中枢神经退行性疾病。我国AD患者600万～800万，呈上升趋势，预计2040年将成为世界第一大发病国［1］。AD的防治是当前亟待解决的社会问题，但是其发病机制及药物治疗仍是医学的重大难题。自噬作为细胞程序性死亡方式之一，能通过清除受损细胞器、错误蛋白质，同时回收必要氨基酸等物质调节机体细胞稳态，在神经细胞衰老中发挥重要作用。

中医将AD归属于“痴呆”“神呆”等范畴，病机与五脏虚弱，脑髓生成乏源或脑络不通，脑髓不纯有关，脑气凝滞皆由气血不畅所致，脑与脏腑之气不接，脑中气血亏虚或不通是痴呆的关键病机。笔者根据痴呆病因病机，结合多年临床经验认为痴呆病机属荣气虚滞范畴。荣气虚，脑脉失养，生髓乏源；又荣气滞，痰浊瘀血内生，相互搏结，蒙蔽清窍，脑髓不纯，二者消长失衡致神机失用，发为呆病。以“阴虚血瘀-荣气虚滞”理论立方的活血荣络方，由鸡血藤30 g，黄精15 g，乳香10 g，川芎10 g，石楠藤30 g，生地黄15 g，没药10 g组成。活血荣络方中鸡血藤、石楠藤共为君，补血活血以通经活络；黄精、生地黄共为臣，补血滋阴以补髓填精，调气机以助鸡血藤、石楠藤补血活血，补真阴以滋脑髓空虚；乳香、没药共为佐，通经活络兼以化瘀止血，助鸡血藤、石楠藤之活血之功，以畅气机；川芎为使，味薄而气芳，升达头目，透畅巅顶，多窍而质不坚，可贯脉透表，内外肢节，携诸药直达病灶。诸药合用，共奏滋阴活血、通经活络之功，对痴呆阴虚血瘀证颇为有效。本研究为进一步揭示活血荣络方治疗痴呆的分子机制，采用生物信息学联合网络药理学方法，从分子网络角度对活血荣络方进行多成分、多靶点分析，并探讨其通过自噬治疗AD的分子机制，为活血荣络方治疗AD提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 活血荣络方有效活性化合物的筛选采用TCMSP［2］（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）数据库，以OB≥30%，DL≥0.18%，BBB≥-0.3为筛选条件［3］，获取活血荣络方君药鸡血藤，臣药黄精，佐药乳香，使药川芎的有效活性化合物。

1.2 活血荣络方靶点与“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点的获取通过PubChem［4］（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）与 Chemspider［5］（http：／／www.chemspider.com／）数据库，获取活血荣络方有效活性化合物3D结构式，并导入Swiss Target Prediction［6］（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）数据库，以获取活血荣络方靶点。

通过GeneCards（https：／／www.genecards.org／）数据库，以“Alzheimer Disease”和“Autophagy”为检索词，以Score值≥10为限定条件筛选疾病作用靶点［7］，以获取AD和自噬的作用靶点。

取“活血荣络方靶点”“AD靶点”与“自噬靶点”的交集，并通过Bioinformatics（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）实验室的“韦恩图”工具，绘制韦恩图。

1.3 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点PPI网络构建通过String［8］（https：／／string-db.org／）数据库，设定最低要求互动分数为中度信度0.400［9］，导入“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点，以获取蛋白互作（PPI）信息。采用Cytoscape 3.7.2中Network analyzer功能分析PPI信息，计算Degree值及可视化，同时结合WebGestalt［10］软件计算“随机游走概率”。

1.4 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点GO和KEGG富集分析通过WebGestalt［10］（http：／／www.webgestalt.org／＃）数据库，采用“ORA”算法，导入“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点，获取GO（BP、CC、MF）和KEGG富集分析数据，进行“加权集合覆盖”分析，并绘制火山图。

1.5 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点miRNA预测及网络分析通过TargetScan［11］（http：／／www.targetscan.org／mamm_31／）数据库，导入“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点，以获取其反向预测的miRNA，利用Cytoscape 3.7.2软件将mRNA-miRNA互作关系可视化。

利用WebGestalt（http：／／www.webgestalt.org／＃）数据库，导入“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点，进行反向miRNA预测，基本参数设定同1.4项下，进行“Network-miRNA”预测和加权集合覆盖分析，将两个数据库筛选并收集的miRNA整合分析。

2 结果

2.1 活血荣络方有效活性化合物的筛选采用TCMSP数据库获取422个活血荣络方活性化合物，君药鸡血藤68个；臣药黄精38个；佐药乳香127个；使药川芎189个，筛选后获得活血荣络方中鸡血藤14个、黄精7个、乳香8个、川芎6个有效活性化合物。见表1。

2.2 活血荣络方靶点与“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点通过Swiss Target Prediction数据库对活血荣络方有效活性化合物靶点进行预测，得到鸡血藤303个靶点，黄精240个靶点，乳香171个靶点，川芎314个靶点，去除重复值保留唯一值，获取567个活血荣络方靶点。

通过GeneCards数据库获取AD靶点，以Score值≥10为限定条件进行初步筛选，共得到286个AD靶点；通过GeneCards数据库获取自噬靶点，共得到4 715个自噬靶点。

利用Bioinformatics取交集获得“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点36个，得到韦恩图见图1，共同分子靶点见表2。

表1 活血荣络方中活性化合物基本信息

2.3 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点PPI网络构建采用String数据库及Cytoscape软件对“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点进行PPI网络分析，得出PPI网络图。设定20≤Degree＜30为红色；15≤Degree＜20为黄色；10≤Degree＜15为蓝色；1≤Degree＜10为粉红色，Degree值越大，节点越大，见图2，靶点蛋白随机游走概率见表3。

图1 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点韦恩图

该网络图中有36个靶点，包含36个节点，245条边，平均聚类系数为0.676，其中包括APP（Degree＝29）、CASP3（Degree＝27）、MAPK3（Degree＝23）、TNF（Degree＝22）、MAPK8（Degree＝22）、IL6（Degree＝22）、CASP8（Degree＝21）、PSEN1（Degree＝21）、MAPK1（Degree＝21）等。结果表明，活血荣络方可能通过多个作用靶点在阿尔茨海默病自噬机制中发挥作用。

图2 “活血荣络方-AD-自噬”共同靶点蛋白PPI网络图

表2 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点

表3 共同靶点随机游走概率分析

2.4 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点GO和KEGG富集分析“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点GO分析，共富集出10个生物进程（BP），结合“P-Value”值，加权集合覆盖后获得5个最相关生物过程，依次为突触信号转导的调控、肽丝氨酸修饰、对氧化应激的反应、对细菌起源分子的反应、积极调控蛋白水解。根据“Ratio”“P-Value”“FDR”值绘制火山图如图3-BP。

“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点GO分析，共富集出29个细胞组分（CC），结合“P-Value”值，加权集合覆盖后获得7个最相关细胞组分，依次为膜区、神经细胞体、轴突部分、突触前、包涵体、去极化增长点、神经脊柱。根据“Ratio”“P-Value”“FDR”值绘制火山图如图3-CC。

“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点GO分析，共富集出16个分子功能（MF），结合“P-Value”值，加权集合覆盖后获得9个最相关分子功能，依次为内肽酶活性、天冬氨酸肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性、蛋白质丝氨酸／苏氨酸／酪氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸／苏氨酸激酶活性、生长因子受体结合、细胞因子受体结合、tau蛋白结合、蛋白质自缔合。根据“Ratio”“P-Value”“FDR”值绘制火山图如图3-MF。

“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点KEGG分析，共富集出9 696条信号通路，结合“P-Value”值，依次为老年痴呆症、细胞凋亡、IL-17信号通路、TNF信号通路、百日咳、非酒精性脂肪肝病、C型凝集素受体信号通路、结核、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、军团菌病。根据“Ratio”“P-Value”“FDR”值绘制火山图如图4。

2.5 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点miRNA预测及网络分析TargetScan数据库中反向预测出共同靶点782个miRNA-mRNA相互作用，在Cytoscape软件中将共同靶点的mRNA设置为“三角形”“红色”；将反向预测的miRNA设置为“圆形”“淡黄色”，可视化如图5。

图3 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点GO富集分析BP、CC、MF火山图

图4 “活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点KEGG富集分析火山图

图5 “活血荣络方-AD-自噬”共同靶点mRNA-miRNA相互作用预测关系

WebGestalt数据库反向预测miRNA，所有共同靶点mRNA富集在88个miRNA中，加权集合覆盖分析后得出10个最相关miRNA，得出“Expect”“Ratio”“P-Value”值，具体见表4。

表4 mRNA-miRNA预测及加权集合覆盖分析后结果

整合两个数据库，明确共同靶点miRNA-mRNA最可能预测关系，即miR-302A-GSK3B；miR-513-ACHE／DRD3／NTRK2；miR -193A／miR -193B-PLAU；miR-217-MAPK1；miR-18AMAPT；miR-200A／miR-141-DRD2／PSEN1／TTR；miR-101-DYRK1A／PTGS2；miR-153-SNCA；miR-520G／miR-520H-DYRK1A；miR-506-CAPN1／ERN1／PSEN1。

3 讨论

《素问·痹论》云：“荣者，水谷之精气也，和调于五脏，洒陈于六腑，乃能入于脉也，故循脉上下，贯五脏，络六腑也。”荣者，滋人体，养神色，主生化也［12］；荣气者，精微物质之总称也，属阴中之阴［13］，“阳化气，阴化形”，人体形态结构、功能代谢及精神意识皆由荣气所化生。荣气为《黄帝内经》中“物质、功能、转化”之气［14］，能滋形骸，荣脑髓，其气化流通得畅，则神机守，神气显，阴平阳秘，气血畅达。故荣气足则五脏俱荣，化髓有源，神机得守，则脑髓得以用，精神佳，记忆强。荣气异常表现为荣气虚、荣气滞［15］，二者同时共存，相互影响转化，荣气虚滞则机体荣养与生发功能障碍。脑为“髓海”“奇恒之腑”，藏脑髓，传神机，为元神之府，为五脏六腑精、气、神汇聚之所。荣气虚滞则脑髓失养，神机失用，五神失职，则灵机退失，发为痴呆，故荣气虚滞是痴呆的基本病机。活血荣络法以滋阴活血为主，滋阴基础上结合脏腑病位联合补气、补血、补精等，活血基础上配伍理气、化痰、清热、泻实等，佐以开窍。

生物信息学是生物医学与计算机科学的综合体，利用数学分析方法，已成为系统生命学的重要组成部分［16］。通过分子网络数据挖掘方法分析DNA、RNA、蛋白质等生物分子以网络整体调控模式参与机体的生命过程。“辨证论治”“整体观念”是中医学基本特色，网络药理学、分子网络数据挖掘等生命信息学从系统整体对药物、疾病、机制进行科学认识，两者具有高度契合度。本研究采用生物信息学方法，挖掘活血荣络方活性成分、筛选分析“活血荣络方-AD-自噬”共同靶点，从分子、基因角度研究活血荣络方通过自噬治疗AD的作用机制。

本研究采用网络药理学方法，得到活血荣络方有效活性化合物中，鸡血藤14个、黄精7个、乳香8个、川芎6个，共预测出567个活血荣络方靶点，提示活血荣络方的治疗作用与其有效活性化合物整体协同调节567个靶点有关。进一步挖掘“疾病-表型”，即“AD-自噬”的靶点，采用韦恩图交集分析“活血荣络方-AD-自噬”共同靶点36个。前期研究结果证实活血荣络方治疗AD主要与上调Wnt5α、Fz5、Ca MKII、AchE、ChAT等靶点有关［17-18］，与本研究网络药理学方法挖掘出的靶点有高度重合，提示活血荣络方可能多靶点调节自噬在治疗AD中发挥的作用。

PPI网络结果表明，“药物-疾病-表型”共同靶点具有整体复杂的网络相互作用关系。活血荣络方主要通过炎症因子、肿瘤坏死因子、细胞程序性死亡因子等多种分子相互作用调节自噬治疗AD。GO、KEGG富集结果表明，活血荣络方能多靶点、多结构、多形式地参与生物进程，预测得出在膜区、神经细胞体、轴突部分等细胞成分中，活血荣络方通过AD信号通路、细胞凋亡、IL-17信号通路、TNF信号通路调控内肽酶、天冬氨酸肽酶、半胱氨酸型肽酶等活性，影响突触信号转导等生命过程。“活血荣络方-AD-自噬”共同分子靶点反向预测miRNA并加权覆盖集合分析结果表明，多个miRNA参与此过程，整合PPI、GO、KEGG数据，推测活血荣络方调节自噬治疗AD中miRNA-531、miRNA-217、miRNA-200A等靶向结合共同靶点mRNA抑制其翻译过程。AD主要病理变化是机体β-淀粉前体蛋白β样蛋白在胞外沉积，从而形成老年斑。APP是跨膜蛋白，能被β-分泌酶、APP切割酶、γ-分泌酶切割形成Aβ，APP／Aβ失衡能使机体内自噬体中Aβ沉积［19］，因此自噬在AD的发生发展中发挥作用。同时研究发现自噬下调会导致APP及γ-分泌酶异常表达，产生毒性Aβ致AD疾病发展［20］。CASP3、CASP8、MAPK3、MAPK8、MAPK1是细胞凋亡通路关键分子，TNF、IL6是炎症相关通路（IL-17信号通路、TNF信号通路）关键分子。大量研究发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族基因可在AD中过表达，如Ayala-Grosso等［21］采用波谱蛋白共定位法证明CASP3在AD患者大脑中表达上调，且Fricker［22］证实其能进一步促进IL-1、IL-1β、TNFα和NO的产生，导致APP基因裂解的Aβ和tau过度磷酸化，从而诱导老年斑形成和神经元程序性死亡。基于前期团队研究成果并结合PPI、GO、KEGG富集分析得出，活血荣络方可能通过多靶点、多途径、多通路，以网络化形式影响多种机制，从而调节自噬治疗阿尔茨海默病，其中主要通过调控AD信号通路中APP与PSEN1分子表达，并协同调控凋亡和炎症反应通路相关分子表达，影响自噬途径治疗AD。

miRNA是一类广泛存在于真核生物中的长度约为22个nt的非编码RNA，一般认为成熟miRNA 5′端的2～8位核苷酸序列为种子序列，是miRNA与靶基因mRNA特异性结合的区域。在哺乳动物中，miRNA形成后主要通过与目的基因mRNA3′UTR（非翻译区）形成不完全互补配对，阻断目的基因表达，从而调控哺乳动物1／3的mRNA表达，参与多种生物学过程，被认为具有极其重要的功能［23］。研究发现miRNA-96能调节mTOR，在血管性痴呆自噬中起关键作用［24］；miRNA-214-3p作为新的神经保护因子在AD中能抑制自噬并减轻神经元 凋 亡［25］；Chen等［26］最 新 研 究 发 现 上 调miRNA-34a能介导SIRT1／mTOR信号通路预防阿尔茨海默病，整合TargetScan、WebGestalt数据库，利用加权集合覆盖分析，得出miR-302A、miR-513、miR-193是最可能参与活血荣络方调控自噬治疗AD的潜在miRNA。Kong等［27］采用μParafloTMmiRNA微阵列分析得出miRNA-193在果蝇AD模型中异常表达，但是其余miRNA尚未在AD疾病中报道，所以筛选出的miRNA是否在活血荣络方调控自噬治疗AD中发挥作用，需要后期进一步实验验证。

综上所述，活血荣络方可能调节自噬治疗AD，其分子机制主要与活血荣络方中的β-谷甾醇、芒柄花黄素、豆甾醇等多种有效活性成分，协同调节APP、SNCA、PTGS2等多靶点与多miRNA，通过发挥内肽酶活性、天冬氨酸肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等多分子功能，在膜区、神经细胞体、轴突部分等多细胞组分中，参与突触信号转导的调控、肽丝氨酸修饰、对氧化应激的反应等多生命进程，激活老年痴呆症、细胞凋亡、IL-17信号通路等多通路有关，为进一步研究及开发活血荣络方提供理论依据。