基于网络药理学探讨赤芍治疗黄疸的作用机制*

李硕，李小科，叶永安

1.北京中医药大学东直门医院，北京100700；2.北京中医药大学肝病研究所，北京100029

黄疸是由于胆红素代谢障碍而致血清中胆红素含量升高，继而出现巩膜、黏膜、皮肤发黄的一种症状和体征［1］，根据病因分为肝细胞性黄疸、溶血性黄疸、胆汁淤积性黄疸、遗传性高结合胆红素血症、先天性非溶血性黄疸。黄疸常见于慢性肝炎、胆汁淤积性肝病或药物性肝损伤患者。除了应积极治疗原发病及常规保肝治疗外，黄疸患者临床常用的退黄药物如熊去氧胆酸、腺苷蛋氨酸、糖皮质激素仍存在应答不佳或不良反应等问题。赤芍为临床常用中药，毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，其主要化学活性成分为芍药总苷，尚含鞣质类、黄酮类、挥发油类等成分［2］。近年来，赤芍在黄疸中的运用逐渐深入，但缺乏其活性成分、作用靶点及通路的研究。由此，本研究运用网络药理学方法挖掘赤芍治疗黄疸的主要成分、关键靶点和信号通路，探讨其功效作用网络及药效作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）；BATMANTCM平台（http：／／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）；Uniport数据库（https：／／www.uniprot.org／）；Gene-Cards（https：／／www.genecards.org／）；人类孟德尔遗传数 据库（OMIM，https：／／omim.org／）；disGeNET（https：／／www.disgenet.org／）；Therapeutic Target Database（TTD，http：／／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）；PubChem数据库（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）；String数据库（https：／／string-db.org／）；Cytoscape软件（version 3.7.1）；R软件及安装包clusterProfiler（x64 version 3.6.1）［3］。

1.2 赤芍活性成分及潜在作用靶点筛选在TSMSP平台中检索“CHISHAO”，得到赤芍的所有化合物成分，将口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18设定为筛选条件，筛选出潜在活性成分。使用PubChem数据库获取化合物PubChem_CID，剔除未被PubChem收录的化合物。利用BATMAN-TCM平台预测候选活性成分的潜在作用靶点，设置Score cutoff＞8，P value＜0.05，删除无对应靶点的活性成分，利用Uniport数据库中的Uni Pro KBt检索功能校正基因名称，删除非人源靶点，获得活性成分与潜在作用靶点相关信息。

1.3 黄疸靶点预测使用GeneCards、OMIM、dis-GeNET、TTD数据库检索关键词“jaundice”“hyperbilirubinemia”获取黄疸相关的靶点，合并靶点基因并去除重复基因。

1.4 药物有效成分-靶点网络构建将赤芍潜在活性靶点与黄疸潜在治疗靶点匹配，得到交集靶点，使用韦恩图表示交集靶点，并运用Cytoscape软件构建药物有效成分-潜在治疗靶点网络。运用Cytoscape软件计算节点连接度（degree），明确赤芍较重要的有效成分。Degree值是关键节点的拓扑特征值之一，表示与某点连接的边的数量，其值越大，表明该点在拓扑结构中越重要。

1.5 PPI网络构建及分析将赤芍治疗黄疸的靶点导入String数据库，物种设置为“homo sapiens”，阈值设置为中等置信度，隐藏游离靶点，获取PPI网络，结果保存成TSV格式并导入Cytoscape软件绘制PPI网络，利用Cytoscape软件中MCODE插件进行模块化分析，设置degree cutoff＞2，K-Core为2，对其特征进行分析，筛选核心靶标模块。

1.6 靶点GO分析和KEGG分析利用R软件及clusterProfiler对赤芍治疗黄疸的靶点进行GO和KEGG富集分析，设定阈值P＜0.05，显示富集的前20位结果，通过生物学过程和信号通路富集分析预测赤芍治疗黄疸的机制。

2 结果

2.1 赤芍主要有效成分筛选及潜在作用靶点收集TCMSP数据库共收集到赤芍119个有效成分，符合筛选条件（OB≥30%，DL≥0.18）的有效成分共29个，将候选有效成分输入PubChem数据库获取化合物PubChem_CID，利用BATMAN-TCM平台预测潜在作用靶点，去除13个PubChem未收录的有效成分和2个预测靶点Score＜8的有效成分，最终确定14个有效成分（见表1）。

运用Uniport数据库校正潜在作用靶点基因名，去除重复基因并删除非人源靶点，最终得到赤芍潜在活性成分靶点228个。

表1 赤芍有效成分

2.2 黄疸靶点收集在GeneCard、OMIM、disGeNET、TTD数据库中检索关键词“jaundice”“hyperbilirubinemia”，分别检索到2036、15、55、1个靶点，合并所有靶点，删除重复基因，共获得与黄疸相关的靶点2 155个。

2.3 有效成分-靶点网络构建将赤芍潜在作用靶点与黄疸靶点匹配，得到交集靶点59个，绘制交集靶点韦恩图（见图1），推测赤芍可能通过这59个靶点对黄疸起到治疗作用。

图1 疾病与药物靶点韦恩图

运用Cytoscape软件构建有效成分-潜在治疗靶点网络图（见图2），图中共包含73个节点，有效成分和潜在治疗靶点相互作用关系为170条边，运用Cytoscape软件计算有效成分degree值（即其作用的靶点数量），在赤芍有效成分中，潜在靶点数量排名前5位的是：β-谷甾醇（36个靶点）；豆甾醇（30个靶点）；菜油甾醇（29个靶点）；豆甾-4-烯-3-酮（16个靶点）；菠菜甾醇（16个靶点）。

图2 赤芍有效成分-潜在治疗靶点网络图

细胞色素P4503A4（CYP3A4）和糖皮质激素受体NR3C1与赤芍有效成分相互作用最为密切，分别被赤芍中7种有效成分调控；其次是雌激素受体ESR1和雄激素受体AR可以分别被6种赤芍有效成分调控。

说明药物与靶点之间具有一药多靶和一靶多药的特点，提示赤芍通过多靶标调控、多环节介入的模式发挥治疗黄疸的作用。

2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选将59个交集靶点导入String数据库获得相互作用关系的网络，得到TSV文件后导入Cytoscape软件中进行PPI网络绘制及网络拓扑分析（见图3）。PPI网络共包含55个节点（4个靶蛋白未参与相互作用），187条连接，degree值越大，其表现的圆形直径越大；其中NR1H4（degree＝23）、AKT1（degree＝19）、CYP3A4（degree＝17）等靶蛋白degree值大，与其他靶蛋白相互作用强，在网络中发挥重要作用。利用Cytoscape软件中MCODE插件进行模块化分析，设置degree cutoff＞2，K-Core为2，对其特征进行分析，筛选出4个核心靶标模块（a、b、c、d），其聚类评分依次是4.889、4.909、3、3。筛选出来的模块在网络中信息传递效率更高，单一靶点对其他节点的影响力更大。

图3 赤芍与黄疸交集靶点PPI网络

2.5 GO和KEGG富集分析将赤芍治疗黄疸的59个靶点进行GO富集分析，根据GeneRatio筛选出富集结果的前20位，并绘制气泡图（见图4）。GO富集分析显示，赤芍治疗黄疸的作用机制与脂质固化、类固醇代谢、脂质运输、酒精代谢、有机羟基化合物生物合成、脂肪酸代谢、脂质分解、次生酒精代谢、类固醇生物合成、类固醇结合、核受体活动、胆汁酸和胆盐转运等生物过程相关。表明赤芍通过调节多种生物过程达到治疗黄疸的作用。

图4 赤芍治疗黄疸靶点GO富集分析

将赤芍治疗黄疸的靶点通过R软件及cluster-Profiler进行KEGG富集分析，设置阈值P＜0.05，并绘制气泡图（见图5）。结果显示赤芍治疗黄疸的作用机制可能与胆汁分泌、非酒精性脂肪肝、ABC转运蛋白、脂肪细胞因子信号通路、PPAR信号通路、胆固醇代谢等信号通路有关，表明赤芍潜在作用靶点可以通过多个通路干预黄疸。本研究发现较多靶点富集在胆汁合成及代谢通路，提示赤芍可能通过调控该通路及下游蛋白，如HMGCR、CYP3A4、RXRA等参与胆红素代谢（见图6）。

图5 赤芍治疗黄疸靶点KEGG富集分析

图6 胆汁合成及代谢通路

3 讨论

中医学认为，黄疸是指因肝失疏泄，胆汁外溢，或血败不华于色，引发以目黄、身黄、小便黄为主要临床表现的病证［4］。《金匮要略》提出黄疸病“从湿得之”，而唐容川《金匮要略浅注补正》云：“瘀热以行，一个瘀字，便见黄皆发于血分，凡气分热不得称瘀，小便黄赤短赤涩而不发黄者多矣……故必血分湿热乃发黄也。”关幼波先生提出“治黄必治血，血行黄易却”的治疗观点，强调应从血分论治，在活血解毒化痰通络基础上辨证施治［5］。周仲瑛教授指出，瘀热是指瘀和热两种病理因素互相搏结、胶结形成的具有新的特质的病理因素，是黄疸的病理基础［6］。说明历代医家对黄疸“瘀血发黄”的病机具有相似的观点。赤芍清热凉血，活血祛瘀，既入肝经，兼入血分，对于治疗黄疸具有较好疗效。《本草经疏》曰：“木芍药色赤，赤者主破散，主通利，专入肝家血分……凉肝故通顺血脉，肝主血，入肝行血，故散恶血，逐贼血……行血凉血。”近年来，中医药在治疗黄疸方面的报道［7-8］不断增加。何堂清等［9］对黄疸病常用处方数据挖掘进行研究，发现赤芍的使用频次位于327种常用中药中的第39位，提示了赤芍在治疗黄疸病中的重要作用。临床研究表明，赤芍对重度黄疸型肝炎患者血清胆红素下降具有促进作用［10-11］。茵陈蒿汤合赤芍汤治疗急性黄疸型肝炎退黄、改善肝功能效果优于使用门冬氨酸钾镁治疗的对照组［12］。

本研究共筛选出赤芍14个主要有效成分。网络拓扑学分析显示，β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇拥有相对较多的潜在靶点。上述三者均属于植物甾醇，可以通过减弱炎症模型下的细胞活力、降低吞噬能力以及NO、TNF-α的生成从而减轻炎症反应症状［13］。已有研究报道，β-谷甾醇及其衍生物对脂多糖／氨基半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用［14］。豆甾醇具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降低胆固醇等药理作用［15］。菠菜甾醇以浓度依赖性方式抑制脂多糖诱导的一氧化氮和促炎性细胞因子的生成［16-18］。

在筛选出治疗黄疸的59个直接作用靶点中，CYP3A4、NR3C1与赤芍有效成分相互作用最为密切。CYP3A4是细胞色素P450家族中最为重要的药物代谢酶，其在外源性物质和内源性物质的代谢中起着极其重要的作用，50%以上的临床口服药物在体内需经CYP3A4的代谢转化［19］。药物经过细胞色素P450代谢亦可形成如电子基、氧自由基等有害活性毒物，毒物形成与解毒之间的平衡对药物性肝损伤的形成至关重要［20］，故通过调控CYP3A4可从加强药物解毒、代谢的角度改善药物性肝损伤引起的黄疸。NR3C1基因调控糖皮质激素受体。糖皮质激素是一种广谱免疫抑制剂，其消退黄疸的主要机制是：减轻门脉区和毛细胆管的非特异性炎症；利于胆汁的排泌，改善全身毒性反应；阻止抗原抗体复合物产生；减少肝细胞免疫损伤；稳定溶酶体膜；减少组织损害；减少血红蛋白分解；减少胆红素生成［21］。糖皮质激素可通过阻止细胞因子的产生和黏附分子的表达而限制T淋巴细胞的活化，同时可选择性抑制B淋巴细胞产生抗体［22］，充分权衡治疗收益和不良反应后可应用于免疫机制介导的胆汁淤积患者，如自身免疫性肝炎、乙型病毒性肝炎等。

PPI网络拓扑学结果显示，NR1H4在网络中处于核心位置，与其他靶蛋白相互作用强。NR1H4基因编码胆汁酸受体法尼酯衍生物X受体（farnesoid X receptor，FXR）通过调节参与胆汁酸的合成及肝肠循环维持胆汁酸稳态。FXR途径参与胆汁淤积的形成和管理，而FXR激活疗法对胆汁淤积具有直接治疗作用［23］。对PPI网络进行聚类分析，获得其中聚类评分较高的4个模块，其中聚类评分最高的模块b中包含ABCB1、ABCC2、SLCO1B3、FABP6、GPBAR1、NFKB1、NR1I2等胆红素代谢相关靶点，提示可能通过调节胆红素代谢发挥治疗黄疸的作用。

赤芍治疗黄疸通路富集分析结果显示，赤芍通过多条通路发挥治疗黄疸的作用，如胆汁分泌、ATP结合盒式（ATP binding cassette，ABC）转运蛋白、PPAR信号通路等。

保证胆汁的正常分泌及代谢在治疗胆汁淤积性黄疸中尤为重要。胆红素从肝细胞分泌至胆小管，再随胆汁进入肠道完成肝肠循环，若胆汁排泄出现障碍，胆红素反流入血，导致血清胆红素水平升高。ABC转运蛋白是一类跨膜运输蛋白，参与细胞内营养物质的吸收和细胞毒性化合物排出［24］，其成员的功能正常，保证胆汁的正常运输，从而避免胆汁淤积疾病的发生，如由ABCB11基因编码的胆汁酸外排泵转运功能正常，保证了胆汁酸在体内的平衡［25］，ABCC2基因异常则会导致结合胆红素在肝细胞内转运和排泄障碍，出现以黄疸为主要特征的Dubin-Johnson综合征［26］。研究表明，激活小鼠的孕烷X受体（pregnane X Receptor，PXR）能增加胆红素的清除［27］。PXR作为胆红素代谢转化的重要调控因子，通过诱导UGT1A1基因表达来影响胆红素代谢消除［28］。另一方面，PXR参与调控药物代谢酶CYP3A4［29］的转录，从而促进肝脏的解毒和代谢功能以缓解黄疸。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα）激活可调节胆固醇代谢并抑制胆汁酸的合成。一项动物实验表明，激活PPARα后，可显著降低血清胆红素水平、减少炎症因子，从而改善肝细胞损伤［30］。

综上所述，本研究应用网络药理学方法系统预测了赤芍治疗黄疸的机制，通过对赤芍的有效成分、潜在靶点及生物学功能和作用通路综合分析，发现赤芍主要通过增加胆汁分泌和转运、提高药物代谢酶含量、调控核受体活性、抑制炎性因子释放等方面治疗黄疸。由此预测，运用赤芍治疗胆汁淤积性黄疸或药物性肝损伤、炎症引起的肝细胞性黄疸可能取得较好疗效，但仍需完善动物实验以及临床研究进一步验证，以提高临床用药的合理性和科学性。