攻下开窍方对肝性昏迷大鼠行为学的影响*

陈旭，张毅，侯文，刘家维，薛瑶瑶，范天祥

1.陕西中医药大学，陕西 咸阳712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳712046

在临床肝硬化患者中的发病率约占30% ～40%，是晚期肝病患者重要死因之一［1-6］。肝移植是目前治疗肝性昏迷最有效的手段之一，但存在受手术后感染、宿主排斥等不良反应，目前保守治疗仍是主要手段［7-9］。攻下开窍方作为多种清热利湿药的合剂，兼有攻下解毒、醒脑开窍之功，协同西医保守治疗肝性昏迷疗效显著［10］。故本研究采用50%的四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）联合硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）诱导大鼠肝性昏迷模型，观察攻下开窍方保留灌肠对肝性昏迷大鼠行为学的影响，以期为肝性昏迷的治疗提供基础实验依据。

1 材料

1.1 动物健康雄性成年SD大鼠90只，体质量220～250 g，购自成都达硕实验动物有限公司［合格证号：2020（陕）-002］，温度20～25℃，湿度60%，昼夜光照时间各12 h，自由饮食饮水。所有实验大鼠操作程序均经陕西中医药大学医学伦理委员会批准实施。

1.2 药物及试剂生大黄30 g，蒲公英30 g，石菖蒲30 g，乌梅30 g，煅牡蛎20 g，芒硝20 g，以上中药均由陕西中医药大学附属医院中药房统一购买，混合后制作成为每克含生药8 g的冻干粉，备用，使用时100℃水溶解。TAA（阿拉丁，批号：T104039）；CCl4（阿拉丁，批号：C128126）。

1.3 仪器Morris水迷宫（上海移数鼠博士RD1101MWM-G）；旷场实验箱（上海欣软公司）；SuperMaze型高通量动物行为实验分析软件（上海欣软公司）。

2 方法

2.1 分组及造模方法造模方法参考宋佰玉［11］制备肝性昏迷大鼠模型的方法。大鼠适应性饲养7 d后，用随机数字表法将90只大鼠分为正常组、模型组、乳果糖组、攻下开窍方高剂量组、攻下开窍方中剂量组、攻下开窍方低剂量组，每组15只，除空白组外，每组大鼠按0.5 mL·100 g-1给予50%CCl4溶剂（50 mL橄榄油+50 mL CCl4）行腹腔注射，每周2次，并根据体质量变化调整剂量，共12周。在第12周后按30 mg·100 g-1给予3%TAA溶液（蒸馏水100 mL+3 g TAA）隔日行腹腔注射，隔天1次，连续2次，正常组大鼠给予等量橄榄油腹腔注射。根据大鼠肝性昏迷诊断标准，若大鼠出现嗜睡、反应迟缓，自主性活动减少、共济失调、昏迷等症状之一，即可诊断肝性昏迷。

2.2 给药方法造模成功后，按照人鼠比重，乳果糖组按6 g·kg-1的剂量给予乳果糖灌肠，攻下开窍方低、中、高剂量组分别以0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1的剂量给予攻下开窍方灌肠，模型组及正常组给予等量蒸馏水灌肠，每日1次，连续给药14 d。

2.3 观察指标及评价指标

2.3.1 大鼠肝性昏迷分级若大鼠出现嗜睡、反应迟缓、自主性活动减少、共济失调、昏迷等症状之一，即可诊断为肝性昏迷，分别在造模前、给药前、给药后参考Zimmermann氏法［12］对大鼠肝性昏迷分级进行评分。等级0：正常（11分）；等级I：嗜睡，反应迟缓，自主活动减少，反射正常（＜11分）；等级II：共济失调，但反射仍基本正常（10～11分）；等级III：反射逐渐消失（＜10分）；等级IV：角膜反射消失，动物昏迷（0分）。

2.3.2 水迷宫实验参考刘美琪等［13］的方法行Morris水迷宫实验，通过水迷宫软件系统记录大鼠在2 min内找到平台的逃避潜伏期，若在规定时间内未找到平台则时间按照120 s计算。

2.3.3 旷场实验参考Wang等［14］的方法行旷场试验，通过计算机软件对影像结果进行分析，得出每只大鼠5 min内运动总距离、单次最大运动距离及穿格次数。

2.4 数据分析所有数据均应用SPSS 21.0统计分析软件进行单因素方差分析，数据以均数±标准差（±s）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 攻下开窍方对肝性昏迷大鼠肝性昏迷分级评分的影响与模型组比较攻下开窍方低、中、高剂量组及乳果糖神经功能反射得分明显升高，肝性昏迷分级明显降低（P＜0.05）；与乳果糖组比较，攻下开窍方中、高剂量组得分明显升高，肝性昏迷分级明显降低（P＜0.05），而攻下开窍方低剂量组未见明显统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经反射得分与肝性昏迷分级的比较 （±s）

表1 各组大鼠神经反射得分与肝性昏迷分级的比较 （±s）

注：与模型组相比：*P＜0.05；与乳果糖组相比：＃P＜0.05

组别n 剂量 神经功能反射得分 肝性昏迷分级正常组15-11.0±0.0 0模型组15-4.1±1.3 2.9±0.5 乳果糖组15 6 g·kg-1 9.0±1.4*2.3±0.4*攻下开窍方低剂量组15 0.5 g·kg-1 7.2±1.7*2.4±0.7*攻下开窍方中剂量组15 1 g·kg-1 8.6±1.5*＃2.0±0.5*＃攻下开窍方高剂量组15 2 g·kg-1 10.7±0.3*＃1.8±0.6*＃

3.2 攻下开窍方对肝性昏迷大鼠水迷宫实验的影响造模前，各组间无差异，说明分组均匀。造模后，与正常组比较，其余各组逃避潜伏期时间明显延长（P＜0.05），说明造模成功。治疗后，与模型组比较，攻下开窍方低、中、高剂量组及乳果糖组逃避潜伏期时间明显缩短（P＜0.05）；与乳果糖组比较，攻下开窍方高、中剂量组逃避潜伏期变化有统计学差异（P＜0.05），而攻下开窍方低剂量组未见明显统计学差异（P＞0.05）。见表2，图1。

3.3 攻下开窍方对肝性昏迷大鼠旷场实验的影响与模型组相比，攻下开窍方低、中、高剂量组及乳果糖组大鼠的运动总距离、穿格次数、单次最大运动距离均明显增加（P＜0.05）；与乳果糖组相比，攻下开窍方中、高剂量组运动总距离、穿格次数、单次最大距离明显增加（P＜0.05）。见表3，图2。

表2 各组大鼠各时间节点水迷宫实验逃避潜伏期的比较 （±s）

表2 各组大鼠各时间节点水迷宫实验逃避潜伏期的比较 （±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05；与乳果糖组相比，＃P＜0.05

组别n 造模前 造模后 治疗后正常组15 8.32±1.26 5.27±1.28*4.12±0.67*模型组15 7.96±0.67 102.23±1.42 112.63±0.91＃乳果糖组15 8.03±1.63 97.48±1.36*18.14±1.02*攻下开窍方低剂量组15 9.35±1.02 101.30±1.41*20.33±1.26*攻下开窍方中剂量组15 8.76±1.83 99.68±1.28*12.21±1.73*＃攻下开窍方高剂量组15 9.13±1.54 96.35±1.56*9.14±1.18*＃

表3 攻下开窍方对肝性昏迷大鼠旷场实验的影响 （±s）

表3 攻下开窍方对肝性昏迷大鼠旷场实验的影响 （±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05；与乳果糖组相比，＃P＜0.05

组别n运动总距离（l／cm）穿格次数／次单次最大运动距离（l／cm）正常组15 2391.76±549.52* 87.19±21.32*14.37±4.61*模型组15 712.51±431.68 21.84±16.75 5.72±1.69乳果糖组15 1691.36±763.59* 65.84±26.75*9.13±5.61*攻下开窍方低剂量组 15 1832.95±658.72* 62.26±30.58*8.61±2.35*攻下开窍方中剂量组 15 2239.68±521.47*＃ 83.98±21.69*＃ 13.16±1.49*＃攻下开窍方高剂量组 15 2128.59±652.18*＃ 79.41±17.55*＃ 12.78±2.56*＃

图1 治疗后各组大鼠定位航行实验活动轨迹图

图2 治疗后各组大鼠旷场实验活动轨迹图

4 讨论

肝性昏迷是肝硬化晚期患者常见的机体失代偿事件，其发病机制尚不明确，氨中毒学说被大多数学者所接受［15-17］。目前公认有效的药物为乳果糖，它可以酸化肠道引起渗透性腹泻，促进肠道乳酸菌生长，改变肠道菌群，使肠道内产氨及氨吸收进入血液循环减少［18-20］。临床上，虽有许多西药用于治疗肝性昏迷，但尚存在不良反应。

攻下开窍方的安全性及有效性已在临床治疗中得以证明［10］。肝性昏迷属本虚标实之病，清阳不升、浊气不降，采用中药灌肠的方法，通过肠黏膜吸收，继承中医的“攻下法”和“开窍法”之说，起到涤肠泻毒、醒脑开窍之功。方中大黄、芒硝、蒲公英三药合用共奏荡涤肠毒、攻下祛邪之功，使浊气自降、清气自升，则神明自清［21-22］；石菖蒲开窍醒神、宁神益智；煅牡蛎滋阴潜阳、收敛固涩，防泻下过多损伤正气；乌梅下气除满、宁心合中［23］。现代药理学研究表明，以上六药均具有降低内毒素、抗菌抗炎、促进肠蠕动、改变肠腔渗透压的作用［24-28］，六药合用，可调节肠道菌群、降低内毒素的产生、使肠道产氨及吸收氨降低、改善肝功能及神经功能。此实验证实，给药后各组大鼠在肝性昏迷分级、逃避潜伏期、运动总距离、穿格次数、单次最大运动距离均具有统计学差异，提示攻下开窍方可增强其空间学习记忆能力及空间自主探索能力，但其机制仍需课题组后期进一步的研究。