4种淫羊藿黄酮苷类主要成分体外药理活性比较

史阔豪, 张光财, 武康雄, 王 彬, 万闽歌, 李 菡*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西商贸学院 医药学院， 陕西 西安 712046)

0 引言

淫羊藿(EpimediiFolium)，别名仙灵脾，首次记载于《神农本草经》，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效[1].黄酮类是其主要活性成分，其中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C与淫羊藿苷结构相似，是淫羊藿标志性化合物，占淫羊藿黄酮类成分的40%～50%，2020年版《中国药典》中将淫羊藿苷作为淫羊藿的质控成分[2,3].淫羊藿属植物中分离得到的活性黄酮大都为C8位具有异戊烯基取代的黄酮醇苷类化合物，淫羊藿苷的结构为在此基础上C4′发生羟基甲基，C7位被葡萄糖取代，C3位为鼠李糖基取代.朝藿定类化合物是淫羊藿黄酮类化合物如淫羊藿苷等经过进一步结构修饰的结果，朝藿定A为在淫羊藿苷C3位鼠李糖基上再连接1个葡萄糖，朝藿定B为连接1个木糖，朝藿定C为连接1个鼠李糖形成二糖取代.4种成分结构式如图1所示.

淫羊藿黄酮在抗肿瘤、增强免疫功能、改善心脑血管功能、调节内分泌、抗骨质疏松、抗炎、增强学习记忆能力和改善生殖功能等方面具有显著的药理活性[3-6].淫羊藿苷已被证明具有骨保护、调节生殖功能、神经保护、免疫保护和抗氧化等作用[7-10].朝藿定C对肉瘤sarcoma-180 细胞以及肝癌SK-Hep-1细胞均表现出抗肿瘤活性[11,12]，提示人们朝藿定类化合物具有可观的药用价值.但目前针对朝藿定类化合物生物活性研究还是较少，继续挖掘该类化合物的生物活性对淫羊藿黄酮类化合物的开发利用具有重要意义.因此本研究通过比较朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C与淫羊藿苷的抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性,以期为淫羊藿以及朝藿定的功能性产品开发和综合应用研究提供技术支持和理论参考.

R1=Rha,R2=Glc,R3=CH3 淫羊藿苷 R1=Rha-Glc,R2=Glc,R3=CH3 朝霍定A R1=Rha-Xy1,R2=Glc,R3=CH3 朝霍定B R1=Rha-Rha,R2=Glc,R3=CH3 朝霍定C图1 四种淫羊藿黄酮苷化学结构式

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料及菌种

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，购自宝鸡辰光生物科技有限公司.

供试菌种：大肠杆菌ATCC-25922和金黄色葡萄球菌EATT-25236，实验室保存.

人肝癌细胞株BEL-7402购自中国科学院上海细胞生物学研究所，本实验室保存.

1.1.2 主要试剂

LB肉汤(北京奥博星生物技术有限责任公司);琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司);生理盐水(中牧股份江西生物药厂);无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司); DPPT、ABTS、K2S2O8(笛医生物科技有限公司)；维生素 C(天津市天力化学试剂有限公司)；青霉素、链霉素(上海源叶生物科技有限公司)；RPMI 1640 培养基( 以色列Biological Industries公司) 、胰蛋白酶(以色列Biological Industries公司) 、WST-1 试剂盒( 博士德(Boster)生物公司); DCFH-DA 荧光探针 (上海碧云天生物技术有限公司) ;其余试剂均为分析纯.

1.1.3 主要仪器

全波长扫描式多功能读数仪(赛默飞世尔科技有限公司)；调速型迷你离心机(上海生工有限公司)；超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司);电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);微量移液器(德国Eppendorf);冰箱(青岛海尔股份有限公司);漩涡振荡仪器(常州诺基仪器有限公司);恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司);恒温振荡培养箱(哈尔滨东联电子公司);流式细胞仪(美国BD有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 抑菌圈的测定

取一张滤纸,用6 mm打孔器将其制备成圆形滤纸片.滤纸片经高压灭菌后烘干，完全干燥后取出贴于加入菌液培养基的平板上，用移液器吸取6μL的药液滴到滤纸上.两组都用液体培养基做空白对照,朝藿定类A、B、C和淫羊藿苷的用药浓度均为10 mg/mL,其中金黄色葡萄球菌组用浓度为10μg/mL的青霉素作阳性对照，大肠杆菌组用浓度为20μg/mL链霉素作阳性对照，做三组平行.置于37 ℃培养箱培养24 h,观察各组的抑菌效果.使用游标卡尺测量抑菌圈的直径,以评价其抑菌的效果.参照抑菌活性判定使用标准，抑菌圈直径d≤6 mm，药物敏感度判定为不敏感；6 mm20 mm，药物敏感度判定为极高敏.

1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用双倍稀释法测定朝藿定类化合物和淫羊藿苷对大肠杆菌的MIC值.用微量加样器分别取各个浓度的药液50μL，依次由低浓度到高浓度加到96孔板中并做好标记.再取50μL的各个菌液加入到96孔板中.同时每个实验菌组设阴性对照组和空白对照组.空白对照孔内加50μL液体培养基和50μL菌液，阴性对照孔内加50μL链霉素和50μL菌液.将96孔板振荡1 min，使孔内菌液与药液混匀后用封口胶密封好，置于37 ℃的恒温培养箱.24 h后，观察菌液的浑浊情况，相邻浓度有明显差距，较澄清的实验组的药物浓度为最低抑菌浓度(MIC).

1.2.3 DPPH自由基清除试验

精密称取12.50 mg DPPH,在250 mL棕色容量瓶中溶解,以无水乙醇为溶剂,得到浓度为0.05 mg/mL的DPPH溶液,避光保存,备用.在试管中加入2 mL不同浓度 (1.562 5μg/mL、3.125μg/mL、 12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷溶液,再加入已经配制好的0.05 mg/mL DPPH溶液2 mL,空白管以无水乙醇代替药液，对照管用无水乙醇代替DPPH溶液.水浴避光30 min,在517 nm波长处测定各溶液的吸光度.每个样品重复测定三次，抗坏血酸为阳性对照.

1.2.4 ABTS自由基清除试验

ABTS水溶液(7 mmol/L)和过硫酸钾水溶液(7.35 mmol/L)等比例混合，室温黑暗条件下反应12～16 h，以无水乙醇稀释调整至在波长734 nm处吸光度为0.70±0.02，制备得到ABTS+溶液.取2 mL不同浓度 (1.562 5μg/mL、3.125μg/mL、 12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL) 的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷溶液，加入5 mL ABTS+溶液，以水代替样品作为空白组，室温反应6 min，于波长734 nm处测定吸光度，并计算自由基清除率I%.平行测定三次，抗坏血酸为阳性对照.

1.2.5 CCK-8法测定抗肿瘤活性

取传代培养生长情况良好的BEL-7402细胞进行实验,96孔板加入200μL含不同浓度药物(终浓度10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的培养液，并设置空白对照组，每组设置3个复孔，分别培养24 h后加入20μL CCK-8溶液培养箱中孵育,酶标仪读取波长450 nm下的OD值,将各测试孔OD值减去空白OD值,细胞存活率%=(加药孔OD-空白OD)/(对照孔OD-空白OD)×100%.

1.2.6 流式细胞仪检测朝霍定C对细胞内活性氧水平的影响

取对数期生长的BEL-7402细胞，以5×106个细胞/孔接种在6孔板，细胞培养箱中培养24 h.每孔加入朝霍定C(10μmol/L，20μmol/L和40μmol/L) 后培养.用PBS洗涤，加入DCFH-DA 荧光探针后孵育30 min，吸掉探针染色液，PBS洗涤，胰酶消化再收集细胞.离心，弃上清用PBS重悬细胞，再离心，最后用流式细胞仪收集检测活性氧(reactive oxygen species，ROS) 水平.

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，数据图中用误差棒表示标准差.组间差异采用单因素方差分析，*P<0.05表示具有显著性差异，**P<0.01表示差异极显著.

2 结果与讨论

2.1 抑菌圈实验的结果分析

从表1的实验结果来看，对于大肠杆菌的抑菌作用，朝藿定A和淫羊藿苷的抑菌圈的直径大于10 mm而小于15 mm均属于中敏；朝藿定B和朝藿定C的抑菌圈的直径大于6 mm而小于10 mm，均属于低敏；表明对于大肠杆菌，四种淫羊藿苷均具有一定的抑菌活性，其中朝藿定A和淫羊藿苷的抑菌活性较强，两者作用相当，而朝藿定B和朝藿定C的抑菌作用较弱.对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，朝藿定A和淫羊藿苷的抑菌圈的直径大于10 mm而小于15 mm均属于中敏；朝藿定B和朝藿定C均无抑菌活性.总的来说，对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，朝霍定A和淫羊藿苷均表现出较强的抑菌活性，具有开发成抑菌药的潜力.

表1 朝藿定A、B、C和淫羊藿苷对大肠杆菌和金

2.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定

朝藿定A和淫羊藿苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的的抑菌活性，进一步采用双倍稀释法检测了最小抑菌浓度(MIC)，如表2所示.结果表明：对于金黄色葡萄球菌，朝霍定A和淫羊藿苷的MIC分别为25和15 mg/mL；对大肠杆菌，朝霍定A和淫羊藿苷的MIC分别为12.5 mg/mL和15 mg/mL.结合抑菌圈测定结果，可以看出朝藿定A和淫羊藿苷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的的生长抑制效果，具有后续抑菌作用研究的潜能.

表2 朝藿定A和淫羊藿苷对大肠杆菌和

2.3 清除DPPH自由基能力的结果分析

由图2所示的实验结果可以看出，在1.562 5～100μg/mL的浓度范围内，朝藿定A、B、C和淫羊藿苷对DPPH的清除作用呈现一定的正相关趋势，随着样品浓度的升高，其对DPPH自由基清除作用也随之增强.用 Excel 软件做统计,得到样品的回归方程并计算出 IC50和 AE，如表3所示.通过比较得出清除 DPPH自由基的清除能力：淫羊藿苷>朝霍定C>朝霍定A>朝霍定B,表明淫羊藿苷结构C3位鼠李糖基上进行糖基取代会减弱其抗氧化性.

图2 样品对DPPH·自由基的清除率 随浓度的变化

表3 样品对DPPH自由基清除效果

2.4 清除ABTS自由基能力的结果分析

ABTS自由基清除能力也是常用的抗氧化活性检测方法.从图3可以看出，朝藿定A、B、C和淫羊藿苷均随着浓度的增加抗氧化能力逐渐增强； 由表4可知，ABTS自由基清除能力：淫羊藿苷>朝霍定C>朝霍定A>朝霍定B,结果和DPPH自由基的清除率呈相关性.可以说明这两种方法基本能够一致地反映4种淫羊藿黄酮的抗氧化活性.

图3 样品对ABTS·自由基的清除率 随浓度的变化

表4 样品对ABTS·自由基清除效果

2.5 CCK8法检测不同淫羊藿黄酮苷对BEL-7402细胞存活率的影响

实验结果如图4所示，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均能够抑制BEL-7402细胞的增殖.随着药物浓度的增加，细胞存活率呈现下降的趋势.同时，相同浓度比较，朝藿定C和淫羊藿苷有更加明显的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖性.

图4 四种淫羊藿黄酮苷对肝癌细胞 BEL-7402生长抑制作用比较

2.6 朝霍定C对细胞内ROS的含量影响

朝霍定C表现出明显的抑制BEL-7402细胞增殖的作用，为进一步研究其作用机制，用不同浓度( 10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L) 的朝霍定C处理BEL-7402 细胞后，检测ROS水平，其试验结果如图5所示.由图5可知，朝霍定C呈浓度依赖性地升高细胞中ROS水平( P<0.05或P<0.01)，表明朝霍定C可能是通过升高细胞内ROS的含量诱导BEL-7402细胞死亡.

图5 朝霍定C对肝癌细胞BEL-7402 ROS含量影响

3 结论

朝藿定类化合物(包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)和淫羊藿苷是中国传统中药淫羊藿的重要活性成分，是淫羊藿活性黄酮的重要组成部分，具有多种药理活性，同时也是喘可治注射液以及仙灵骨葆胶囊等成药的主要成分，具有可观的药用价值[1-5,13,14].因此研究朝藿定类化合物的生物活性具有重要意义，也为其他淫羊藿活性黄酮类化合物的开发研究提供借鉴.

本研究比较分析了朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的抗氧化、抑菌与抗肿瘤活性.其中，在抑菌圈和微量稀释法评价四个淫羊藿黄酮苷的抑菌实验中，抑菌效果最佳的是朝霍定A和淫羊藿苷，对金黄色葡萄球菌的MIC ，朝霍定A为25 mg/mL，淫羊藿苷为15 mg/mL；对大肠杆菌的MIC，其朝霍定A为12.5 mg/ mL，淫羊藿苷为15 mg/mL.

实验表明，朝霍定A和淫羊藿苷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较强的抑菌效果，而朝霍定B和朝霍定C的抑菌作用较弱.通过检测ABTS自由基和DPPH自由基清除能力确定化合物的抗氧化活性，结果表明四种淫羊藿黄酮苷的抗氧化活性为：淫羊藿苷>朝霍定C>朝霍定A>朝霍定B,提示淫羊藿苷结构C3位鼠李糖基上进行糖基取代会减弱其抗氧化性.在CCK8法测定四种活性成分对肝癌细胞BEL-7402的生长抑制作用中，四种化合物均体现出一定的增殖抑制作用，以朝霍定C和淫羊藿苷的增殖抑制作用最为突出，进一步研究朝霍定C的作用机制，表明朝霍定C可能是通过升高细胞内ROS的含量诱导BEL-7402细胞死亡.

尽管通常认为黄酮类化合物是天然高效抗氧化剂，能抑制ROS的产生而防止氧化应激损伤，起到细胞保护作用[15].但近年来，多项研究提示黄酮化合物对细胞内氧化还原状态的影响可能与药物浓度相关，不同药物浓度作用甚至产生截然不同的影响，推测黄酮类化合物是发挥促氧化还是抗氧化作用可能与其在细胞内的代谢产物组分和细胞本身的氧化还原状态相关[16-18].肿瘤细胞与正常细胞内氧化还原水平不同，有研究报道某些黄酮类如儿茶素能通过氧化还原反应使口腔癌细胞中ROS含量呈剂量依赖性升高，诱导产生氧化应激，而将正常细胞中活性氧调制正常水平[19]，表明不同研究体系中各黄酮化合物生物活性不一致甚至相互矛盾.

本研究中朝藿定C具有一定清除DPPH和ABTS自由基的作用，但当作用浓度为10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，作用于肿瘤细胞BEL-7402时，又能升高ROS的含量起到抗肿瘤作用.本项目采用生物活性为导向筛选，为淫羊藿黄酮苷化合物药用价值的利用提供依据.本文仅从抗菌、抗氧化和抗肿瘤对淫羊藿黄酮苷化合物进行了初步比较，后续还应从不同角度(作用机制、构效关系等)深入探究其活性规律.