加压溶剂萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定植物源性食品中的氟吡菌胺

张振洋

(英格尔检测技术服务(上海)有限公司， 上海 201109)

0 引言

氟吡菌胺(fluopicolide)，化学名称为 2,6-二氯-N-[(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)甲基]苯甲酰胺(结构式见图1[1])，是由德国拜耳作物科学公司开发的苯甲酰胺类杀菌剂，该产品具有优良的系统传导性和较强的薄层穿透力，对病原菌各主要形态均有较好的抑制作用，能够为新叶、茎干、块茎、幼果提供全面和持久保护，主要应用于葡萄和蔬菜种植中，对霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等常见卵菌纲病害具有良好防效，而对作物和环境则相对安全[2-5].

图1 氟吡菌胺的化学结构式

目前，氟吡菌胺已在世界范围内被广泛应用于蔬菜、水果和粮作物的疾病防治[6]. 植物源性食品中氟吡菌胺的残留检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法[7]和气相色谱-串联质谱法[6-9]，前处理一般采用的是农产品检测快速样品前处理技术(简称QuEChERS)[10]，固相萃取[11]、液液萃取[12]和分散固相萃取[6-8]，后两种前处理法属于传统前处理方法，费时且消耗大量的有机试剂；QuEChERS[13]前处理法虽在时间上比传统的固相萃取、液-液萃取和分散固相萃取[14]有优势，有机试剂消耗少，但是QuEChERS法是在非密闭条件下进行，且萃取液无法浓缩处理；使用QuEChERS 前处理法对植物性样品中的色素是无法去除的，大浓度的色素对后续质谱分析会产生一定的影响. 同时，在前处理过程中需要加入凝胶渗透色谱(GPC)粉，GPC粉用量对目标物质的影响目前尚未有详细的研究。另外，对于含水量低或者脂肪含量高的样品，净化效果不理想，提取效率低、净化过程损失大.

本研究建立了一种以乙腈为萃取剂，在密闭条件下采用加压溶剂萃取，结合高效液相色谱串联质谱法测定植物源性食品中氟吡菌胺残留量的分析方法。该方法具有前处理简单、萃取率高、检出限低、准确度和精密度高等优点.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂Agilent 1290 Infinity Ⅱ/6460 Triple Quad LC-MS/MS高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，配AJS ESI离子源；电子天平(Sartorius，BT25S)：德国赛多利斯公司，感量为0.1 mg；快速萃取仪：E-916型(BUCHI Labortechnik AG)；涡旋混合器：QL-866，其林贝尔(海门)；氟吡菌胺标准物质：农残级，CAS：239110-15-7，100.3 mg/L；氟吡菌胺标准储备溶液Ⅰ：10.03 μg/mL，称取氟吡菌胺标准物质1.00 mL于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度；氟吡菌胺标准储备溶液Ⅱ：1.00 μg/mL，移取1.00 mL储备液Ⅰ于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度；乙腈：农残级；甲醇：农残级.

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱：C18 2.1×100 mm×3.5 μm； 柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相：A(5 mmol乙酸铵-0.1%甲酸水溶液)，B(甲醇)梯度洗脱.梯度洗脱条件见表1.

表1 梯度脱洗程序

1.2.2 质谱条件 离子源温度：350 ℃；电喷雾电压：4.0 kV；干燥气：氮气；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监测(MRM)；保留时间、定性及定量离子对、锥孔电压、碰撞能量及保留时间见表 2.

表2 质谱采集参数

1.2.3 快速溶剂萃取仪条件 加热温度100 ℃，载气压力100 psi，静态萃取5 min，萃取池淋洗体积为60%池体积，氮气吹扫时间60 s，循环静态萃取次数为2次.

1.3 试验方法准确称取约5 g植物源性粉碎样品，与一定量的无水硫酸钠充分混匀、脱水，反复研磨成细小颗粒，全部转移至萃取池中，以乙腈为萃取剂进行快速溶剂萃取。萃取液经自动浓缩仪浓缩至约0.5 mL，用萃取溶剂准确定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜后转移到自动进样小瓶中，按上述仪器条件进行测定.

2 结果与讨论

2.1 氟吡菌胺标准品的高效液相色谱-串联质谱分析按上述色谱条件，待仪器稳定后连续注入氟吡菌胺标准溶液，直至连续两次进样仪器响应保留时间相对变化小于1%。其色谱和质谱分别见图2与图3. 可见，氟吡菌胺保留时间为5.12 min，响应值最大的子离子质荷比为172.9，次级响应离子质荷比为364.9.

图2 氟吡菌胺标准溶液色谱图

图3 氟吡菌胺标准溶液质谱图

1-索氏提取；2-超声提取；3-加压溶剂萃取图4 不同提取方法对氟吡菌胺回收率的影响

2.2 萃取条件的选择

2.2.1 不同提取方法的比较 对比了索氏提取、超声提取和加压溶剂萃取3种不同提取方法的回收率，见图4. 可以看出，加压溶剂萃取法回收率明显高于索氏提取和超声提取法. 在整个萃取过程中，加压溶剂萃取仪器始终处在密闭的高温、高压下进行，而高温和高压有助于提高氟吡菌胺在溶剂中的溶解度，显著提高了萃取效率. 其次，在密封的条件下减少了挥发损失，从而也有助于提高萃取效率.

2.2.2 萃取溶剂的选择 萃取溶剂的选择对目标化合物的提取影响非常大。分别选择甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-二氯甲烷(1∶1)和丙酮-二氯甲烷(1∶2)为提取溶剂，固定加热温度120 ℃，载气压力120 psi，静态萃取15 min，萃取池淋洗体积70%池体积，氮气吹扫时间90 s，循环静态萃取次数2次，按照色谱条件进行检测，考察萃取溶剂对氟吡菌胺回收率的影响，结果见图5.

由图5知，在相同实验条件下，乙腈的回收率最高，达到了95%～98%，明显优于其他萃取溶剂，因此本试验选择乙腈作为萃取溶剂.

1-正己烷；2-甲醇；3-乙腈；4-丙酮；5-正己烷-二氯甲烷；6-丙酮-二氯甲烷图5 萃取剂对氟吡菌胺回收率的影响

2.2.3 萃取溶剂的用量 萃取剂乙腈的用量是影响试验结果的重要因素之一，试验对比了乙腈用量分别为5、10、15、20、25、30 mL时对氟吡菌胺回收率的影响，结果见图6.

图6 萃取溶剂的用量对氟吡菌胺回收率的影响

由图6知，随着乙腈用量的不断增加，目标化合物氟吡菌胺的回收率先逐渐升高，后逐渐趋于平衡，乙腈用量在15 mL时，氟吡菌胺回收率达到最高值，平均回收率在90%以上. 显然少量的乙腈不能够将目标物质完全的萃取，随着乙腈用量增加，氟吡菌胺萃取效果达到最优，回收率达到最高值，但随着萃取溶剂用量不断增加，萃取达到相对动态平衡，回收率变化不明显. 通过试验最终确定萃取溶剂乙腈用量最佳为15 mL.

2.2.4 静态萃取时间和萃取压力的选择 分别设定静态萃取时间为2、3、5、8、10、12 min，考察萃取回收率。图7显示，萃取5 min时，回收率在90%以上，再延长萃取时间，目标物的回收率基本不变，故静态萃取时间选择5 min。分别选择50、70、100、120和150 psi萃取压力，考察回收率的变化，结果见图8. 可见，氟吡菌胺的萃取回收率随着萃取压力的增加而逐渐提高，在100、120和150 psi萃取压力下，回收率无明显变化，因此，萃取压力确定为100 psi.

图7 萃取时间对氟吡菌胺回收率的影响

图8 萃取压力对氟吡菌胺回收率的影响

2.3 液相色谱和质谱分析条件的优化分别考察了甲醇-10 mmol乙酸铵+0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol乙酸铵+0.1%甲酸水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相对氟吡菌胺分析的影响，结果显示，甲醇-5 mmol乙酸铵+0.1%甲酸水溶液为流动相时，目标物峰形最佳，响应最灵敏.

文献报道的氟吡菌胺液相色谱-质谱联用法一般采用电喷雾离子正离子模式[5]，本文中在全扫描模式下对比了正、负离子模式下氟吡菌胺的响应，结果表明，在正离子模式下氟吡菌胺灵敏度更高，因此选择正离子模式进行分析.在MS/MS模式中，以锥孔电压48 V进行目标物的子离子检测，以丰度最大(m/z)172.9作为定量离子，以次灵敏响应离子m/z364.9作为定性离子，优化质谱分析参数见表2.

2.4 标准曲线和检出限将氟吡菌胺标准储备溶液用乙腈逐级稀释成0.025 μg/mL、0.050 μg/mL、0.125 μg/mL、0.250 μg/mL、0.500 μg/mL标准系列溶液，准确称取与试样基质相应的阴性试样5 g(精确至0.01 g)，分别加入标准系列溶液200 μL，与试样同时进行提取，制成最终浓度为5.00 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL标准系列工作溶液。按仪器条件对系列进行测定，在5.00～100 ng/mL范围内，浓度值与其对应的峰面积呈线性关系，标准曲线回归方程为Y=48 697X-4 711，相关系数R2>0.999 0，定量限为1.00 μg/kg.

2.5 精密度和准确度试验称取6份5 g样品，在线性范围内分别加入低、中、高系列浓度分析物，按照前处理过程和仪器条件对6份样品进行测定，计算相对标准偏差(RSD%)和加标回收率，结果如表3所示.

表3 精密度和准确度试验结果 (n=6)

2.6 样品测定随机抽取三家菜市场，每一菜市场选取2种日常食用蔬菜，分别为白菜、西蓝花、西红柿、黄瓜、芹菜和四季豆，按照本方法的前处理和仪器条件进行分离分析，结果在上述蔬菜中均未检测出氟吡菌胺残留.同时，对种植过程中喷洒了氟吡菌胺农药的芹菜和白菜分别进行残留量测定，结果见表4.其中，芹菜和白菜的施药剂量均为953(a.i.) g/hm2，施药次数均为3次，采集样品时间至最后一次施药完成后的第7 d.

表4 氟吡菌胺在芹菜和白菜中的残留量 (μg/kg，n=3)

3 结论

本工作建立了以乙腈提取，加压溶剂萃取-高效液相色谱-三重四级串联质谱法测定植物源性食品中氟吡菌胺残留量的方法，提取方法操作简单，目标化合物损失小，准确度高，且方法线性良好、精密度、准确度均能满足定量限在1.00 μg/kg的检测分析要求，适用于植物源性食品中氟吡菌胺农药残留量的检测.