基于分子感官科学的烟用香精关键香气活性成分分析

杨鹏飞 张增辉 何春雨 杨靖 贾春晓 毛多斌

摘要：采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用技术分析烟用香精中的挥发性成分，利用气相色谱-质谱-嗅觉检测器联用技术结合香气提取稀释分析确定其香气活性成分，同时对香气活性成分进行定量分析并计算其香气活性值，通过香气重组实验与缺失实验确定烟用香精的关键性香气活性成分.结果表明：在烟用香精中共鉴定出54种挥发性成分，其中有22种香气活性成分;结合香气稀释因子和香气活性值确定了17种重要香气活性成分;最终确定烟用香精中的关键香气活性成分为β-大马酮、芳樟醇、乙基麦芽酚、乙酸芳樟酯、乙酸橙花酯、月桂烯、橙花醇、乙酸香叶酯、D-柠檬烯、苯甲醇.

Abstract：The volatile chemical components of tobacco flavor were prepared by simultaneous distillation extraction and analyzed using gas chromatography|mass spectrometry.The aroma|active violates were determined by means of gas chromatography|mass spectrometry|olfactometry combined with aroma extraction dilution analysis，and the important odorants were further screened out according to quantitative study and odor activity values.Aroma recombination and omission experiments identified the key odorants of the tobacco flavor.The results exhibited that simultaneous distillation  extraction of tobacco flavor included 54 kinds of volatile compounds，including 22 aroma|active compounds，and 17 odorants were screened out as the predominant odorants according to flavor dilution factors and odor activity values.β|damascarone，linalool，ethyl maltol，linalyl acetate，neryl acetate，myrcene，nerol，geranyl acetate，D|limonene，and benzyl alcohol were confirmed as the key odorants of tobacco flavor.

關键词：烟用香精;气相色谱-质谱-嗅觉检测器联用技术;香气活性成分;香气活性值

Key words：tobacco flavor;GC|MS|O;aroma|active constituent;odor activity value

中图分类号：TS41+1

文献标识码：A文章编号：2096-1553（2021）02-0034-09

0 引言

对卷烟生产而言，加香可以在一定程度上提高烟叶等级、增加卷烟甜润度、补充香气和掩盖杂气，从而使烟草制品燃吸时产生良好的烟气效果，在中式卷烟的生产和研制过程中发挥着关键作用.烟用香精是一种烟草制品添加剂，是卷烟生产中的重要原料之一[1].烟用香精是由两种或两种以上香料与辅料按照一定配比，再通过特殊调配工艺制成的香料混合物，对烟草制品的致香作用至关重要[2].然而，我国关于烟用香精的研究起步较晚，香精深加工欠缺，国内烟草行业的仿香和调创香多依赖于调香师的主观经验.随着国家烟草专卖局大力发展中式卷烟，对烟用香精也提出了更高的要求，因此有必要对烟用香精的关键致香成分进行剖析，进一步实现部分香精使用香料单体调配、拥有自主核心技术的目标.

气相色谱-质谱-嗅觉检测器联用（GC|MS|O）

技术是研究食品香精的有力手段，已广泛应用于各种食品的香气和风味分析.

该技术将现代分析仪器与人的感官相结合，通过保留指数、气味和MS数据库匹配鉴定样品中的芳香活性化合物，并对香气物质进行表征[3-4].Y.Takakura等[5]运用GC|MS|O技术，通过香气稀释因子（Flavor Dilution Factor，FD 因子）、重组实验和缺失实验鉴定出牛肉汤中4种关键香气活性成分.O.Lasekan等[6]运用GC|O技术结合感官评价发现，2-甲基丁酸甲酯、己酸甲酯等8种化合物对菠萝香气品质的影响最大.J.P.Munafo 等[7]将芒果中香气活性值>8的芳香化合物按照其天然质量浓度重组，成功模拟出芒果的香气.D.Langos等[8-9]通过分子感官科学方法确定了酒类中的关键香气活性成分，并成功模拟出巴伐利亚小麦啤酒和朗姆酒的整体香气.范彬彬[10]采用GC|MS|O联用技术分析3种典型菊花精油样品，经缺失实验确定菊花精油中的关键香气物质，通过对菊花香精进行调配，研究其在卷烟加香中的应用效果.目前，鲜见将GC|MS|O技术应用于烟用香精的分析研究，鉴于此，本文拟以烟用香精为研究对象，采用同时蒸馏萃取法（SDE）提取烟用香精的挥发性成分，通过GC|MS|O技术结合香气提取稀释分析（AEDA）筛选鉴定烟用香精的香气活性成分，并通过定量实验计算其香气活性值以获得重要香气活性成分，最后结合重组实验、缺失实验模拟烟用香精的香韵轮廓，确定关键香气活性成分，以期为保持卷烟产品风格和针对性调香提供依据，进而为中式卷烟调香提供新的方法和思路.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

主要材料与试剂：烟用香精，河南中烟技术中心提供;无水Na2SO4（分析纯），烟台市双双化工有限公司产;CH2Cl2（色谱纯），山东禹王和天下新材料有限公司产;食用酒精（纯度≥95%），郑州奥利实业有限公司产.

标准品和内标：苯甲醛、橙花醇，上海斯信生物公司产;月桂烯、β-大马酮、反式石竹烯、苯甲酸苄酯，西格玛奥德里奇公司产;D-柠檬烯、萜品油烯、乙基麦芽酚、乙酸芳樟酯，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司产;苯甲醇、α-松油醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产;芳樟醇、乙酸苄酯、4-萜品醇、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、石竹素、十四酸乙酯，阿达玛斯试剂有限公司产;乙酸香叶酯，阿法埃莎（中国）化学有限公司产，2，6-二氯甲苯，百灵威科技有限公司产.以上试剂纯度均大于97%.

主要仪器：XR-1000ML型同时蒸馏萃取装置，郑州科技玻璃仪器厂产;DLSB-5/20型低温冷却液循环泵、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵、WB-2000型水浴锅、R-1001VN型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司产;HH-S2型数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司产;ZDHW型调温电热套，北京中兴伟业仪器有限公司产;7890A-5977B型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司产;Sniffer 9000型嗅闻检测仪，瑞士 Brechbühler 公司产;MS205DU型精密电子天平（感量0.000 01 g），瑞士梅特勒-托利多公司产.

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

取烟用香精10 mL于1000 mL圓底烧瓶中，加入300 mL超纯水和50 g 无水Na2SO4，连接同时蒸馏萃取装置一端，放置于电热套待加热;取100 mL CH2Cl2置于60 ℃恒温水浴锅中，连接同时蒸馏萃取装置另一端，两端同时加热;水相回流开始计时，回流2.5 h后停止反应;将100 mL CH2Cl2萃取液加入无水Na2SO4中，静置3 h，过滤后通过旋转蒸发仪将CH2Cl2萃取液浓缩至2 mL，取1 mL过微孔滤膜后，待GC|MS检测分析.

1.2.2 GC|MS分析条件确定

GC分析条件：

HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱;进样口温度为280 ℃;载气为He（≥99.999%）;恒流流速为1.0 mL/min;进样口温度为 280 ℃;升温程序设置初始温度为50 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至100 ℃，保持4 min，以2 ℃/min升至170 ℃，保持4 min，以2 ℃/min升至280 ℃，保持0 min.所有待测样品均为不分流进样，进样量均为1.0 μL.

MS分析条件：传输线温度为280 ℃;离子源温度为230 ℃;四极杆温度为150 ℃;电离方式为电子轰击电离（EI）;电离能量为70 eV;溶剂延迟时间为6.0 min;采用全扫描监测，扫描范围为35～500 amu，定量时采用选择离子检测（SIM）扫描.

1.2.3 定性分析

采用NIST14谱库检索，将标准品进行比对，并结合保留指数RI[11]、嗅闻香气特征进行定性分析.

1.2.4 香气活性成分分析

GC分析条件：色谱柱及升温条件同1.2.2中HP-5MS毛细管柱的升温程序，不分流进样，载气（N2）流速1.8 mL/min，进样量1.0 μL.样品经进样口解析和GC色谱柱分离后，分别进入MS检测器和嗅闻检测仪，分流比为1GA6FA1.

嗅闻检测仪测试条件：接口温度200 ℃，加热线温度250 ℃，N2输出流量15 mL/min.6位嗅闻评价人员在嗅闻端口记录所闻到的香味特征和保留时间.

AEDA条件：将1.2.1中SDE提取物样品用无水乙醇按照2n（n=0，1，2，3）逐级进行稀释，稀释后的液体依次经GC|O分析，直至6位嗅闻评价人员在嗅闻端口感受不到任何化合物的气味为止.嗅闻评价人员记录不同化合物的香气和最后闻到某香气化合物的稀释倍数，嗅辨结果人数≥2认为结果可靠.FD因子为6位嗅闻评价人员嗅闻到每个化合物的最大稀释倍数.

1.2.5 定量分析

对1.1中的化合物标准品进行定量分析，用CH2Cl2将各标准品配制成单标，然后依次配制成9个不同质量浓度的混标;以2，6-二氯甲苯为内标，进行GC|MS分析，建立内标标准曲线，计算SDE提取物中香味活性成分的含量.

其余香气活性成分采用半定量分析，根据内标物的含量、内标物的相对峰面积与目标物的相对峰面积计算目标物质的含量，公式如下：

其中，ρ 为目标物质的含量/（μg·g-1）;ρIS为内标物的含量/（μg·g-1）;A为目标物质的相对峰面积;AIS为内标物的相对峰面积.

1.2.6 香气活性值计算

通常，当化合物的香气活性值≥1时，认为该化合物对混合物整体香气有贡献，香气活性值越大则贡献度越大.各香气化合物的香气活性值计算公式如下：

香气活性值=某体系中香气化合物的浓度某香气化合物的香气阈值

1.2.7 香气重组、缺失实验及关键香气活性成分验证

将1.2.1中CH2Cl2萃取液浓缩至微干，用体积分数为70 %的乙醇溶液定容至 10 mL，记为香气原样（Original Aroma，OA）.

将17种关键香气成分按照烟用香精中香气活性成分的定量结果，加入体积分数为70 %乙醇溶液，定容至10 mL，记为香气重组模型（Aroma Recombinate，AR）.

对上述模型的感官属性进行评价，感官评价小组采用10分制的记录方法对不同香韵的香气强度进行打分（0分代表无，5分代表中等，10分代表最强）.以所得各香韵分数绘制香韵轮廓图.

由10位经过培训的嗅闻评价人员进行描述性测验，并比较重组液和原液的气味，通过不断修正和改善模型中单体香料的含量，最终得到重组模型.

AEDA和香气活性值分析是建立在烟用香精经SDE基础之上的，故应将重组样品香韵轮廓与烟用香精中的CH2Cl2萃取物香韵轮廓进行对比.在成功建立重组模型的基础上，按照香韵分类将各化合物逐一去除，对比重组模型判断香气变化，得到烟用香精的关键香气活性成分，最后按照重组模型中化合物的含量，将关键香气活性成分进行重组，得到缺失模型.

将烟用香精样品和缺失模型香精样品以2/10 000（以烟丝质量计）的比例分别等量注入参比卷烟中，为加香样品组和对照样品组;将两组样品同时置于恒温恒湿（（22±2） ℃，（60±5）%）环境中平衡48 h以上，备用.

2 结果与讨论

2.1 烟用香精中挥发性成分定性分析结果

将烟用香精样品经SDE提取后进行 GC|MS 联用分析，烟用香精中挥发性成分定性分析结果如表1所示.

由表1可知，从烟用香精中共鉴定出54种挥发性化合物，其中酯类化合物最多，占化合物总数的41%.乙酸芳樟酯具有清甜花果香，香气优雅，天然存在于薰衣草、香紫苏、酸橙油等精油中，其中在香紫苏油中可达54.3%[13-14]，是玳玳花香精油的重要成分[15].乙酸香叶酯具有玫瑰花熏衣草香，带有柑橘和酒香.苔色酸乙酯存在于树苔浸膏中，为苔清香香氣的关键成分[16].亚油酸乙酯具有温和的脂肪香、果香.

醇类物质也是烟用香精中重要的挥发性成分，共检测到6种，分别是α-松油醇、芳樟醇、橙花醇、4-萜品醇、L-α-松油醇、苯甲醇.其中，α-松油醇、芳樟醇、橙花醇、4-萜品醇、L-α-松油醇互为同分异构体，分子式均为C10H18O;苯甲醇具有特有的令人愉悦的果香气息，天然存在于甜橙油、依兰油中[17].

烟用香精中共检测到2种酮类化合物，分别是乙基麦芽酚和β-大马酮.其中，乙基麦芽酚具有焦糖样甜香与水果香气，香气浓郁易挥发、留香持久[18];β-大马酮香气惬意，具有强烈的玫瑰花香和茶叶、烟草的香气，能够影响烤烟的香气量和香气质[19].

烟用香精共检测到13种烯烃类化合物，其中月桂烯、D-柠檬烯、萜品油烯、别罗勒烯、α-蒎烯、反式石竹烯、蛇麻烯、γ-依兰油烯、β-甜没药烯、δ-杜松烯均是萜烯类化合物，月桂烯、D-柠檬烯、萜品油烯、别罗勒烯、α-蒎烯是一萜烯类化合物，互为同分异构体，分子式都为C10H16;反式石竹烯、蛇麻烯、γ-依兰油烯、β-甜没药烯和δ-杜松烯都是倍半萜烯类化合物，也都互为同分异构体，分子式都为C15H24.

2.2 烟用香精中香气活性成分鉴定结果

采用SDE法提取烟用香精中的香气成分，结合GC|O分析，通过AEDA的分析方法筛选香气活性成分，结果如表2所示.

由表2可知，本研究共鉴定出22种香气活性成分.由FD因子可知，贡献率较大的香气活性成分为酮类，其中β-大马酮的FD因子最高（FD因子为1024），其次为乙基麦芽酚（FD因子为256）.其他FD因子>7的香气活性成分依次为芳樟醇（FD因子为512），乙酸芳樟酯、乙酸橙花酯（FD因子为64），萜品油烯、乙酸苄酯（FD因子为16），橙花醇、乙酸香叶酯、月桂烯（FD因子为8）.其余香气活性成分的FD因子较低，说明它们对烟用香精的贡献不大.因此，β-大马酮、芳樟醇、乙基麦芽酚、乙酸芳樟酯、乙酸橙花酯、萜品油烯、乙酸苄酯、橙花醇、乙酸香叶酯、月桂烯可被视为烟用香精的关键香气活性成分.

2.3 烟用香精中香气活性成分的定量及香气活性值分析

采用内标法对烟用香精样品中香气活性成分的含量进行定量或半定量分析，并对香气活性值进行计算，以补充和支持这些香味活性成分对烟用香精整体香韵的贡献，结果如表3所示.

由表3可知，查阅到香气阈值数据的20种香气活性成分中，香气活性值≥1的香气活性成分共有17种，表明它们均对烟用香精的香气有贡献作用.香气活性值≥40的香气活性成分有14种，表明它们是烟用香精中的关键风味化合物，其中β-大马酮的香气活性值最高，其次是乙基麦芽酚、芳樟醇、乙酸芳樟酯、月桂烯.另外，烟用香精中含量最高的是苯甲醇（7 306.48 μg/mg），较高的依次是乙基麦芽酚（2 643.36 μg/mg）、 β-大马酮（954.94 μg/mg）、乙酸芳樟酯（505.49 μg/mg）、芳樟醇（295.13 μg/mg）、α-松油醇（125.53 μg/mg）、乙酸香叶酯（86.63 μg/mg）、乙酸橙花酯（46.67 μg/mg），这些物质的香气活性值也较大，对烟用香精的香气贡献较大.其中，苯甲醇呈花香，含量较高，是茉莉花、茶叶等植物中重要的香气成分[20-21].

由表3也可知，香气活性值的结果与FD因子的结果较为一致，其中，苯甲醇、D-柠檬烯等香气活性成分在烟用香精中具有较高的香气活性值，但是在GC|O|AEDA中未被嗅闻到，这可能是因为在整体香气贡献中，实际香气组分相互具有协同或拮抗效应，而香气活力值的应用是建立在“食物整体香气特征仅仅是每种香气活性成分香气属性的简单叠加”这一假设之上的[22].香气活性值法和AEDA法各具特点，在实际应用中常需将两种方法结合使用[23].结合FD因子和香气活性值分析，以FD因子≥8、香气活性值≥40为判断标准，初步推测烟用香精中关键香气活性成分为苯甲醇、乙基麦芽酚、β-大马酮、乙酸芳樟酯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸香叶酯、乙酸橙花酯、橙花醇、苯甲酸苄酯、月桂烯、苯甲醛、D-柠檬烯、反式石竹烯、萜品油烯、乙酸苄酯、亚麻酸共17种香气活性成分.

2.4 重組实验和缺失实验结果分析

2.4.1 重组实验结果

由图1所示烟用香精（OA）与相应重组（AR7）样品的香韵轮廓图可以看出，AR7模型的整体香韵轮廓与OA基本一致，但清（青）香、花香和甜香较OA弱一些，果香持平.感官评价小组对比二者发现：初闻时OA整体香韵表现较AR7协调，更加丰富浓郁，这种差异表现在OA中清香、花香、甜香、果香四者整体协调性比AR7好，给人一种怡人、甜蜜的舒适感，而AR7整体香韵不如OA丰富，花香和甜香的协调性稍差一些;静置30～60 s后，除甜香外，二者整体差异基本消失，

整体香韵轮廓基本一致，OA的清香、甜香更持久一些，但是较初闻时已有减弱;放置3 min左右，二者整体香韵轮廓基本一致.90%的嗅闻评价人员认为，AR7最接近模型OA，重组成功.

2.4.2 缺失实验结果

基于2.4.1中确定的重组模型AR7中各化合物的含量进行缺失实验.按照香韵分类，逐一减少某香韵中的化合物，通过感官评价绘制香韵轮廓图，并与OA香韵轮廓对比后得出：芳樟醇、乙酸橙花酯、橙花醇、乙酸香叶酯、苯甲醇、β-大马酮、乙基麦芽酚、D-柠檬烯、乙酸芳樟酯、月桂烯10种化合物是OA中的关键香气活性成分，而苯甲酸苄酯、亚麻酸是OA中的非关键香气活性成分.

2.4.3 关键香气活性成分验证

按照重组模型AR7中化合物的含量，将缺失实验得到的10种关键香气活性成分进行重组，得到缺失模型OE9，将OE9与香气原样OA进行感官对比，二者香韵轮廓基本一致.

另外，将1.2.7节的加香样品组与对照样品组分别由13位经过培训的评吸专家组成的评吸委员会进行专业评吸，两组样品在卷烟烟气香气方面评吸结果基本一致.

综上所述，进一步验证了β-大马酮、芳樟醇、乙基麦芽酚、乙酸芳樟酯、乙酸橙花酯、月桂烯、橙花醇、乙酸香叶酯、D-柠檬烯、苯甲醇10种化合物为烟用香精的关键香气活性成分.

3 结论

本文采用SDE结合GC|MS技术对烟用香精的挥发性成分进行分析，鉴定出54种挥发性化合物，通过GC|O结合AEDA法确定了22种香气活性成分，其中，FD因子≥8的香气活性成分有10种.利用内标法对鉴定出的重要香气活性成分进行定量分析，并计算香气活性值，其中，香气活性值≥40的香气活性成分有14种.结合FD因子和香气活性值，初步推测有关键香气活性成分17种.通过香气重组与缺失实验，最终确定烟用香精的关键香气活性成分为10种，分别为β-大马酮、芳樟醇、乙基麦芽酚、乙酸芳樟酯、乙酸橙花酯、月桂烯、橙花醇、乙酸香叶酯、D-柠檬烯、苯甲醇.本文研究结果可为中式卷烟调香提供新的技术和思路，为中式卷烟配方技术的深入研究提供理论参考.由本研究确定的关键香气活性成分组成的香精在卷烟中的应用还需进一步研究，从而为中式卷烟调香技术的开发提供更深入的指导.

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