miR-206靶向Cx43调控ERK1/2通路在兔激素性股骨头坏死中的作用

席源，罗高斌，魏桂清，覃文涛，薄占东

1.广西医科大学第一附属医院骨关节外科，南宁 530021；2.中国人民解放军南部战区总医院骨科医院，广州 510010

股骨头坏死是临床常见的难治性疾病，后期可导致股骨头塌陷并继发严重的功能障碍，致残率极高，多数患者最终需选择关节置换等外科治疗。近年来由于激素的广泛运用，糖皮质激素已成为非创伤性股骨头坏死的重要致病因素[1,2]，且口服皮质类固醇对股骨头缺血性坏死的病理发展有持续性影响[3]。但其确切机制尚不明确，多种治疗方法的疗效不尽人意。探索激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）发病机理，对SANFH 的诊治有重要意义。本组前期研究证实，SANFH 患者股骨头内微小RNA（MicroRNA，miR）-206 表达上调，同时缝隙连接蛋白（connexin，Cx）43 表达下调，提示Cx43/miR-206 参与SANFH 的发生发展[4]。据载，Cx43高表达可激活细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2 信号通路，进而促进成骨分化[5]。本研究检测兔SANFH 模型中miR-206、Cx43、ERK1/2 及Runx2表达变化，探讨Cx43/miRNA-206 及其下游ERK1/2 通路在SANFH 中的作用，初步阐明其机制，期为SANFH 诊治提供新的理论支持。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康新西兰大白兔（广西医科大学实验动物中心提供并代为饲养，实验动物使用许可证号：SYXK 桂2014-0003），质量（2.5±0.3）kg。

1.1.2 主要试剂及仪器 注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（辉瑞制药，比利时），大肠杆菌内毒素（sigma，美国）；miRNA 原位杂交试剂盒（EXIQON，丹麦）；鼠抗-Cx43（Santa，美国）、兔抗-ERK1/2、兔抗-P-ERK1/2、鼠抗-βtubulin（CST，美国），鼠抗-Runx2（Abnova，中国台湾）；IRDye 800CW goat anti-mouse IgG（H+L）、IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG（H+L）二抗（Licor，美国）；磷酸酶抑制剂PhosSTOP（Roche，瑞士），RIPA 裂解液（强）、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（生工生物，中国），免疫组织化学试剂盒（博士德，中国）；总RNA 小量制备试剂盒（Corning，美国）、PrimeScript ™RT reagent Kit 和TB Green®Premix Ex Taq™II（Takara，日本）。TDH-500 原位杂交仪（奥盛，中国），Mini-PROTEAN3 电泳槽和Mini Trans-Blot 转印槽（Bio-Rad，美国），ABI 7500 Fast 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems，美国）；Gyroscan T5-NT 磁共振成像仪（Philips，荷兰）。

1.2 方法

1.2.1 激素性股骨头坏死模型构建与分组 成年新西兰大白兔60 只，均分为实验组和对照组；替补实验动物数只。实验组兔耳缘静脉注射内毒素（10 mg/kg），24 h 后重复1 次，随即臀肌注射甲强龙（20 mg/kg），共4 次，每次间隔24 h；注射内毒素前1 d 肌注青霉素钠（8×104U）+兰索拉唑（10 mg），1 次/d，共7 次。对照组兔注射等量生理盐水。注射后第2 周、8 周和16 周，行核磁共振（MRI）检查。检查后随机取实验组和对照组各10 只动物予以空气栓塞处死，取出双侧股骨头，按冠状面切为薄片，PBS 溶液冲洗，一半置于4%多聚甲醛溶液固定，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 mm 切片，HE 染色，应用Image-Pro-Plus 软件计数空骨陷窝，计算各组空骨陷窝率。T1 加权像表现为点状、细线状、片状低信号或T2 加权像表现为点状、细线状、片状高信号；骨小梁排列紊乱、变细或断裂，骨小梁内出现弥漫性空骨陷窝或核皱缩，伴周围骨髓细胞坏死诊断为股骨头坏死。

1.2.2 免疫组织化学检测 按上述方法制备组织切片，60 ℃烘烤30 min，常规脱蜡至水，10%H2O2溶液处理以灭活内源性酶，0.01 mol/L 枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）高压修复抗原，滴加5% BSA 室温封闭20 min。滴加羊抗-Cx43 一抗4 ℃过夜，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3 次，滴加聚合HRP 标记抗羊IgG，37 ℃孵育30 min，DAB 显色，镜检。每张切片选取3 个高倍视野，应用Image-Pro-plus 软件测量积分光密度值（IOD），并行统计学分析。

1.2.3 miRNA-206 原位杂交 组织切片脱蜡、水化，滴加蛋白酶K 孵育10 min，PBS 洗2 次，梯度酒精脱水；滴加25 ml 杂交混合液于50～60 ℃杂交1 h，1%山羊血清封闭15 min，再加入DIG-AP 抗体（10：800）室温孵育1 h；PBST 洗3 次，加入AP 底物，30 ℃避光孵育2 h，水洗2 次；细胞核染液复染，镜下观察。

1.2.4 荧光定量PCR 检测（1）按试剂盒说明书提取样本总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 质量，紫外分光光度计计算RNA 浓度。（2）按PrimeScript™RT reagent Kit 说明书进行逆转录。（3）实时荧光定量：对逆转录产物进行qPCR 扩增。通过计算2-△△Ct值统计各组目的基因表达的差异。各基因引物见表1。1.2.5 Western blot 检测 用RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂（体积比100：1：1）提取总蛋白。蛋白定量后，取30 mg 蛋白质行SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳后转至NC 膜，5%BSA 室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜（工作浓度Cx43 为1：5000，ERK1/2 为1：1000，P-ERK1/2为1：2000，Runx2 为1：2000，β-Tubulin 为1：10000）。二抗室温孵育1 h（工作浓度为1：10000），Odyssey 成像系统拍照，IPP 软件测定条带灰度值，采用目的条带与β-Tubulin 条带的灰度比值表示目的蛋白相对表达水平（其中P-ERK1/2 条带与ERK1/2 条带相对比）。

表1 荧光定量PCR 引物序列Tab.1 qPCR-specific primer sequence

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 激素性股骨头坏死模型制作结果

在建模过程中，2 周和8 周实验组兔分别死亡3只和2 只，16 周无死亡，死亡兔予以补足。对照组无死亡。MRI 检查：对照组兔股骨头为正常信号影；实验组兔股骨头T1 加权像显示股骨头斑块状中度信号影，T2 加权像表现为不均匀高信号影，伴随关节积液（图1）。HE 染色：对照组骨小梁完整，空骨陷窝少见（图2A）；实验组骨小梁变细、断裂，骨小梁内空骨陷窝增多，髓腔组织中脂肪细胞直径增大（图2B～D）。股骨头内空骨陷窝率（%）：2 周实验组（13.91±2.20）、8周实验组（16.98±1.73）和16 周实验组（20.74±1.92）明显高于同期对照组（7.83±1.25）、（8.71±1.63）和（8.98±1.72），差异均有统计学意义（t=7.599，P=0.000；t=11.002，P=0.000；t=14.427，P=0.000）。

图1 股骨头MRI 检查结果A：实验组T1 加权像 B：实验组T2 加权像 C：对照组T1 加权像 D：对照组T2 加权像蓝色箭头指斑块状信号影 红色箭头指关节积液Fig.1 MRI imaging of bilateral femoral headsA：T1WI coronal scan of rabbits in the model group; B：T2WI coronal scan of rabbits in the model group; C：T1WI coronal scan of rabbits in the control group; D：T2WI coronal scan of rabbits in the control groupBlue arrow:plaque signal shadow;Red arrow:joint effusion

经MRI 检查和HE 染色筛选，2 周和8 周实验组分别有3 只和1 只动物股骨头未出现典型坏死而被剔除。模型成功率为70%。

2.2 免疫组织化学染色检测Cx43 表达

免疫组织化学染色阳性为棕黄色，正常情况下Cx43 阳性表达于成骨细胞、骨细胞及髓腔中。检测发现，对照组股骨头强阳性表达Cx43，2 周、8 周和16周实验组较对照组染色明显减弱。IOD 结果显示：2周实验组IOD（39.43±4.47）较2 周对照组（59.23±7.90）降低，差异有统计学意义（t=6.898，P=0.000）；8 周实验组IOD（32.34±4.52）较8 周对照组（61.53±5.65）明显降低，差异有统计学意义（t=12.757，P=0.000）；16 周实验组IOD（27.14±6.50）较16周对照组（60.77±6.36）明显降低，差异有统计学意义（t=11.694，P=0.000），见图3。

2.3 原位杂交检测结果

原位杂交检测，紫蓝色为阳性MiR-206，核为粉红色。实验组miR-206 强阳性表达于髓腔、成骨细胞和少量骨细胞内，对照组miR-206 仅少量表达于髓腔和成骨细胞内（图4）。

2.4 qPCR 检测结果

图2 股骨头组织病理检查结果（HE 染色）A：对照组 B：2 周实验组 C：8 周实验组 D：16 周实验组蓝色箭头指脂肪细胞 黑色箭头指空骨陷窝 红色箭头指断裂的骨小梁Fig.2 HE staining of the femoral heads in the two groupsA: control group; B：model group of 2 weeks; C：model group of 8 weeks; D：model group of 16 weeks； Blue arrow: fat cells；Black arrow:empty lacuna； Red arrow:fractured trabecular bone

图3 免疫组织化学染色检测Cx43A：对照组股骨头Cx43 强阳性表达于骨小梁边缘成骨细胞，骨细胞和髓腔内 B：2 周实验组股骨头Cx43 阳性表达于成骨细胞和髓腔内 C：8 周实验组股骨头内Cx43 弱阳性表达于成骨细胞和髓腔内 D：16 周实验组股骨头内Cx43 弱阳性表达于成骨细胞和髓腔内 E：Cx43 免疫组织化学染色IOD 比较*与同期对照组比较，P＜0.01Fig.3 Cx43 ISH stainingA:Cx43 of the femoral head of the control group was positively expressed on the trabecular bone marginal osteoblasts,osteocytes and intramedullary cavity;B: Cx43 of the 2 weeks model group was positively expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; C: Cx43 of the 8 weeks model group was weak expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; D:Cx43 of the 16 weeks model group was weak expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; E:IOD comparison of Cx43 ISH staining;*Compared with the control group at corresponding time points,P ＜0.01

图4 原位杂交检测miR-206对照组（A）股骨头内仅少量miR-206 表达于髓腔和成骨细胞内，2周（B）、8 周（C）和16 周（D）实验组股骨头内见大量miR-206 表达于成骨细胞、骨细胞及髓腔Fig.4 ISH of miR-206A: Only a small amount of miR-206 expression was in the medullary cavity and osteoblasts in the femoral head of the control group; B,C and D:A large amount of miR-206 expression was in osteoblasts,osteocytes and medullary cavity in the femoral head of model group at 2、8 and 16 weeks

图5 qPCR 检测2 周、8 周、16 周实验组和对照组miR-206（A）、Cx43（B）和Runx2（C）相对表达量统计图*与对照组比较，P＜0.05Fig.5 qPCR of miR-206(A)、Cx43(B)and Runx2(C)in model group and control group at different times*Compared with the control group,P＜0.05

qPCR 检测显示，miR-206 在实验组股骨头内表达较对照组上调，造模后第2 周、8 周和16 周，实验组股骨头内miR-206 表达量与对照组股骨头内miR-206 表达量的比值即2-△△ct为（2.85±0.09）、（2.91±0.11）和（3.28±0.12），差异有统计学意义（t=45.961，P=0.000；t=38.825，P=0.000 和t=42.484，P=0.000）；Cx43、Runx2 mRNA 在实验组股骨头内表达较对照组均减少，造模后第2 周、8 周和16 周，实验组股骨头内Cx43 表达量与对照组股骨头内Cx43 表达量的比值即2-△△ct为（0.40±0.06）、（0.33±0.04）和（0.24±0.04），差异有统计学意义（t=-18.424，P=0.000；t=-37.442，P=0.000 和t=-42.472，P=0.000）；实验组股骨头内Runx2 表达量与对照组股骨头内Runx2 表达量的比值即2-△△ct为(0.82±0.09)、(0.69±0.04)和(0.51±0.05)，差异有统计学意义(t=-4.472，P=0.002；t=-17.324，P=0.000和t=-21.909，P=0.000)，见图5。

2.5 Western blot 检测

造模后2 周、8 周和16 周，Western blot 分析显示，实验组股骨头内Cx43、Runx2 蛋白相对表达量均低于对照组股骨头，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后2 周实验组股骨头内磷酸化ERK1/2 表达量与对照组无统计学差异（P＞0.05），造模后8 周和16 周，实验组股骨头内磷酸化ERK1/2 相对表达量均低于对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。

3 讨论

3.1 成骨分化与SANFH

图6 免疫印迹检测2 周、8 周、16 周实验组和对照组Cx43、ERK1/2 和Runx2 相对表达量（A）及其统计图（B）*与对照组比较，P＜0.05Fig.6 Immuno blotting results A:Western blot of Cx43,ERK1/2 and Runx2 in model group and control group at 2,8,16 weeks；B：Relative expression of Cx43,ERK1/2 and Runx2 in model group and control group at 2,8,16 weeks*Compared with the control group,P ＜0.05

骨的发育塑形由成骨细胞、骨细胞和破骨细胞协同完成，成骨细胞参与骨基质的合成、分泌及矿化等，在骨发育成熟和修复重建过程中起重要作用。研究发现，SANFH 模型中成骨细胞分化能力显著下降，成骨细胞数量减少及功能降低引起成骨分化不足，引发早期股骨头坏死修复障碍[6]。激素可上调成脂相关基因（如PPAR-γ），同时下调成骨相关基因（如Runx2/Cbfa1），导致间充质干细胞成脂分化增加而成骨分化减少，成骨细胞生成减少[7,8]。自体成骨细胞移植可有效改善股骨头坏死后的修复[9]。Runx2 属于runt 结构域基因家族，能够激活并启动MSCs 向成骨细胞系分化。应用地塞米松诱导大鼠SANFH 模型研究发现，模型鼠股骨头内Runx2 和osterix 基因表达、蛋白合成均较对照组减少[10]。本实验应用内毒素联合激素诱导兔SANFH 模型发现，实验组兔股骨头内Runx2 基因及蛋白表达均低于对照组，且随时间推移有下降趋势。以上结果表明，成骨分化在早期SANFH 中发挥重要作用，激素可能通过抑制成骨分化影响正常骨代谢，参与SANFH 的发生发展及修复过程。

3.2 miR-206 及其靶蛋白Cx43 在SANFH 中的作用

MicroRNA 是动植物中广泛存在的一类分编码单链小分子RNA，在调节正常细胞增殖、分化及凋亡方面发挥重要作用，与骨的正常发育、塑形和维持密切相关[11]。早期研究认为miR-206 特异性表达于骨骼肌[12]，而Inose 等[13]、Zhang 等[14]发现成骨细胞同样表达miR-206。在C2C12 细胞成骨分化过程中，miR-206 下调，而过表达miR-206 则可抑制成骨细胞分化。在人骨髓间充质干细胞成骨诱导的第7 d 和第14 d，miR-206表达显著下调，miR-206 过度表达的BMSCs 碱性磷酸酶（ALP）活性减弱，成骨标志物Runx2 和骨桥蛋白（OPN）的mRNA 水平显著下调[15]。进一步研究表明，骨组织中一个重要的缝隙连接蛋白Cx43 是miR-206的靶蛋白，Anderson 等[16]研究表明，Cx43 基因的3，非翻译区有两个可以与miRNA-206 完全互补的序列，从而抑制Cx43 mRNA 的翻译，减少Cx43 表达，以减少正在生成的肌纤维间的通讯，进而促进肌肉细胞分化。Inose 等[13]研究显示在成骨细胞转染miR-206 后，Cx43 蛋白表达减少，成骨细胞分化能力减弱，而转染anti-miR-206 后，Cx43 蛋白的表达增加，促进成骨细胞分化。

Cx43 可通过调控骨细胞和成骨细胞功能参与骨的发生与塑形。在MC3T3-E1 成骨细胞中，过表达Cx43 会加强Runx2 的依赖性转录活性；反之，以siRNA 干扰Cx43 表达，Runx2 则受到抑制[17]。骨髓基质细胞成骨分化过程中Cx43 表达明显增加，慢病毒介导的Cx43 表达下调后，成骨分化被抑制[18]。本研究显示，miR-206 表达定位于股骨头骨小梁周边的骨细胞、成骨细胞及髓腔内，且实验组股骨头内表达较对照组增多；Cx43 及其mRNA 在实验组股骨头内表达均低于正常组。推测miR-206 可能通过下调Cx43导致了SANFH 的进展。值得一提的是，本研究观察到实验组股骨头Cx43 mRNA 水平也降低，此结果和Inonse 等[13]研究结论有所出入，推测可能存在其他miRNA 或信号通路在SANFH 病程中对Cx43 基因转录具有调节作用，这需进一步研究。

3.3 ERK1/2 信号通路在SANFH 中的作用

本研究结果显示，各时期实验组兔股骨头内ERK1/2 蛋白磷酸化水平均低于对照组，说明ERK1/2信号通路在SANFH 中被抑制。ERK1/2 通路是丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）系统中最为重要的通路之一，MAPKs 是细胞内执行信号级联放大的一种蛋白，可将信号从细胞表面传导至细胞核的重要介质，参与细胞生长发育、分裂活化和凋亡等多个生理过程。而ERK1/2 通路与成骨细胞增殖和分化密切相关[19,20]。细胞外信号如生长因子，与细胞膜上相应受体结合促进ERK 磷酸化，促进成骨转录因子Runx2 和osterix 表达，进而促进成骨细胞的分化和增殖[21]。Cx43 半通道开放可借助激活ERK1/2 信号通路，抑制促凋亡蛋白Bad，激活CAAT/增强子结合蛋白β（C/EBP β）的抗凋亡作用，从而抑制细胞凋亡，促进成骨细胞和骨细胞存活[22]。Cx43 高表达还可激活ERK1/2 信号通路，促进成骨相关转录因子Runx2 表达[4]。本研究发现实验组兔股骨头内Cx43、Runx2 基因表达下调，Cx43、ERK1/2、Runx2 蛋白表达也下调，表明SANFH 兔模型Cx43 下调，抑制了ERK1/2 信号通路，导致成骨分化障碍和骨细胞凋亡增加，参与SANFH 的发生发展。

据此推测，miR-206 可通过调低Cx43 水平，导致骨细胞间通讯“故障”，进而成骨障碍，最终引发SANFH；更进一步，Cx43 低表达可影响其下游ERK1/2 通路，引起成骨细胞分化障碍，参与SANFH 的发展过程。miR-206 和其目的蛋白Cx43、ERK1/2 或许是SANFH 诊疗新的切入点，miR-206 抑制剂可能对SANFH 的防治有正面效果。