四氧嘧啶诱导兔妊娠期糖尿病模型的建立及相关研究

董建中，杜 斌

(中国人民解放军第968医院，辽宁 锦州 121000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妇女在妊娠期发生或首次发现的不同程度的糖耐量异常性疾病，包括部分孕前已存在糖代谢异常而妊娠期被首次诊断的患者[1]，其患病率在亚洲妇女中为5%～10%，并且该比例在我国和某些发展中国家仍在不断上升[2]。妊娠期糖尿病占妊娠期间的糖尿病80%以上[3]，未加控制的妊娠期高血糖可对母婴产生较大的围生期及远期危害，因此对妊娠期糖尿病的研究在临床和科研方面受到越来越多的重视。探索建立一种妊娠期糖尿病实验动物模型是对本病深入研究的基础。以往所建立的糖尿病动物模型多为非妊娠期动物且所用动物多为雄性[4]，对建立妊娠期糖尿病实验动物模型的文献罕见，本实验主要探索建立妊娠期糖尿病动物模型的有效方法。目前建立糖尿病动物模型主要以高糖食物诱发、化学药物诱导和手术切除胰腺等方法为主。食物诱发与人类糖尿病发病机制比较接近，但耗时长，饲养条件要求严格且动物的死亡率高，限制了其应用[5]；而化学药物诱发糖尿病具有方法简单、血糖稳定、耗时短等优点，应用相对广泛[6]；手术切除胰腺具有创伤严重及影响胰腺外分泌，现已很少使用[7]。目前常用诱发动物糖尿病的化学药物有链脲佐菌素(streptozocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)[8]，由于链脲佐菌素(streptozocin，STZ)价格昂贵，建模成功率低，目前已较少使用。ALX诱导动物糖尿病模型具有经济、方便、耗时短和动物糖尿病模型稳定等优点。本研究采用ALX成功地建立了妊娠期新西兰兔糖尿病模型，并对其生物行为学、血糖和胰岛素水平及胰岛的病理组织学等改变进行了观察，探讨其安全性、稳定性、有效性和可行性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1实验动物：健康成年新西兰孕兔54只，由中国医科大学动物实验室购买，兔龄1～1.5年，体质量3.0～4.3 kg，平均(3.87±0.24)kg，妊娠12～13 d，平均(12.30±0.46)d。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2实验药品、试剂与仪器

1.2.1实验药品：ALX(美国Sigma公司生产)，用前以注射用灭菌生理盐水配制成质量浓度5%的溶液，并用0.22 nm纤维素膜滤过除菌，用于诱导妊娠期兔糖尿病模型。

1.2.2血糖、尿糖及血胰岛素测定仪器及试剂：德国罗氏MODLAR D/P型全自动生化分析仪，温州市维日康生物科技有限公司生产的葡萄糖检测试剂盒，罗氏血糖仪及试纸。H-800全自动尿分析仪，试纸为瑞迪H-800。胰岛素测定试剂为美联免疫永附实验(ELISA)试剂盒(RnD公司)。

1.2.3标本处理：胰腺标本用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋后进行5 μm的连续切片，用苏木素-伊红染色(HE染色法)后光镜(DMD108观片机由Leica Microsystems公司)下观察胰岛组织变化及β细胞凋亡情况。

1.3实验方法：实验动物分组及模型制作：购回孕兔后，为降低死亡率，均在新环境条件下饲养2 d，观察孕兔活跃、多动、机警及皮毛光泽。禁食12 h后取晨尿测尿糖，阴性为合格孕兔。按给药剂量的不同将孕兔随机分为A组(对照组)和B组、C组(实验组)共三组，均静脉抽血检测空腹血糖及胰岛素值，求其平均值作为基础的空腹血糖值(兔空腹血糖正常参考值为4.33～8.61 mmol/L)及胰岛素基础值。A组6只孕兔经耳缘静脉给予注射15 ml生理盐水；B组36只孕兔按100 mg/kg ALX经耳缘静脉注射，48 h后测血糖，诱导模型不成功者，继续按100 mg/kg ALX静脉注射，直至模型成功；C组为12只孕兔按130 mg/kg ALX静脉注射，48 h后测血糖，诱导模型不成功者继续按130 mg/kg ALX静脉注射，直至模型成功。

三组均在给药后密切观察6 h，并用血糖仪随机检测血糖，如有低血糖者及时用50%的葡萄糖液15 ml灌胃。注射ALX满48 h后开始检测尿糖，每天1次；禁食12 h后经耳缘静脉抽血检测空腹血糖，隔日1次。以尿糖持续(++)以上、血糖连续1周超过16.7 mmol/L并且保持稳定为诱导模型成功[9]。期间观察孕兔的饮食、尿量及精神状态等情况。于第1周、2周及4周将造模成功的孕兔任取之一处死，取其胰腺做病理组织学观察，并与正常孕兔胰腺组织学观察结果进行比较。

2 结果

2.1静脉注射ALX后孕兔一般状况：A组新西兰孕兔在精神状态、饮食、活动等方面无明显的变化，体重增加(0.23±0.05)kg。B组和C组在给药24 h后出现精神状态差、少食懒动、皮毛松散、失去光泽及脱毛等症状，其中16只孕兔出现流产，流产后5只兔死亡，兔在死亡前出现惊厥、尖叫、角弓反张等症状。1周后模型成功并成活的32只孕兔出现多食、多饮、多尿及体重略上升(0.22±0.03)kg等症状。

2.2各组孕兔糖尿病模型成功率、流产率及死亡率的比较：A组6只孕兔糖尿病模型成功率、流产率及死亡率均为0；B组模型成功率明显高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)，C组的流产率及死亡率均显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3注射ALX前后孕兔血糖及胰岛素水平的变化：在给药前后，经耳缘静脉抽血检测所有孕兔的空腹血糖及胰岛素值，见表2。在给药后2 h测血糖值略有升高[(7.10±0.65)mmol/L]，但差异无统计学意义(P>0.05)；在给药后6 h血糖值下降明显(4.23±0.27)mmol/L；给药72 h后孕兔空腹血糖值均大幅上升(34.31±5.62)mmol/L，其中血糖>40 mmol/L的孕兔7只即时给予皮下注射胰岛素(1 U/kg)，防止孕兔因高血糖引起流产及高渗性昏迷，甚至死亡。用药 1周后血糖处于较高水平并保持相对稳定。各组于用药后第2周、第4周查空腹血糖及胰岛素值。见表2。

2.4胰腺病理组织学观察：正常孕兔胰腺HE染色后在低倍镜可见，胰岛形体规整、数量较多、分布密集；高倍镜下可见胰岛轮廓圆润及边缘整齐，β细胞于胰岛内密集分布，见图1a。与对照组相比，孕兔糖尿病组胰腺在低倍镜下可见胰岛呈萎缩状，数量减少明显，分布较稀疏，胰岛β细胞的密度降低，见图1b；在高倍镜下见不到完整胰岛，其形态不规则，边缘不整齐，胰岛胞浆内空泡样变明显见图1c；β细胞排列紊乱，细胞核不规则、缩小，部分核浓染、核固缩，染色质分布不均并聚集在核周，β细胞数明显减少并分布在胰岛周边，大部分β细胞呈空泡状，见图1d。

表1 给药后三组孕兔成功率、流产率及死亡率的比较

表2 三组孕兔注射ALX前、注射ALX后第2周及4周血糖及胰岛素水平的比较

图1 术前胸椎黄韧带骨化MR、CT

3 讨论

糖尿病是一种发病率较高的代谢性疾病，其并发症对人类有较高的致残率和死亡率，而妊娠期糖尿病对胎儿、婴儿及孕产妇的危害更大，如易发生巨大儿、肩难产、出生后低血糖、低钙和呼吸抑制等；孕产妇易发生流产、早产、妊娠期高血压病及羊水过多等严重并发症[10-11]。建立妊娠期糖尿病动物模型对妊娠期糖尿病的基础与临床研究具有一定的科学意义。四氧嘧啶诱导的糖尿病模型是目前最常用的1型糖尿病动物模型之一，是评价糖尿病的药物治疗及安全性的常用造模方法[12-14]，其机制是ALX化学性质极不稳定，易与SH基(主要是半胱氨酸)发生反应，而胰岛的β细胞中SH基含量较其他组织多，故四氧嘧啶只选择性地损害胰岛的β细胞 ，使其合成胰岛素减少，引起内分泌功能紊乱，从而导致血糖升高、负氮平衡及体重下降而诱发该模型糖尿病[12]。此时糖尿病模型动物可出现高血糖、尿糖、多饮多食等典型的人类糖尿病症状。以往所建糖尿病动物模型多为非妊娠动物，孕期糖尿病动物模型罕见，本文选用新西兰孕兔对其施加ALX，成功地建立了妊娠期糖尿病模型，该模型高血糖及低胰岛素水平稳定且持续时间长，有明显的糖尿病症状，胰岛病理改变明显，与人类糖尿病病理生理改变相似，所用方法具有造模时间短、操作简单、成本低、成功率高及易复制等优点[15]，以此方法建立的妊娠期糖尿病动物模型可用来了解妊娠期糖尿病对孕产妇和胎儿及新生儿的影响，并为本病发生机理和临床治疗的研究提供了条件，具有一定的妇产科学意义。

采用ALX诱导动物糖尿病模型应注意[16-17]下几方面：因为ALX具有水溶性，长时间溶于水会降低药效，故应现用现配；用药前试验用兔应空腹，但禁食时间不宜过长，时间超过24 h会增加兔的死亡率，以往研究及本实验也证实了以禁食12 h为佳；ALX剂量过大，增加药物的毒性，引起动物大量死亡，剂量过小而造模成功率低。本研究表明，剂量在100 mg/kg，按此体重剂量重复给药相对理想，而130 mg/kg组孕兔发生流产率和死亡率均较高。另外造模成功率还受动物的体重、动物的年龄、ALX的生产厂家、药物的给药途径及给药速度等因素的影响。本研究是参考有关文献[18-19]，选用ALX的用量为100 mg/kg及130 mg/kg两个量组，用药后观察孕兔糖尿病模型的成功率及对流产率和死亡率的影响。本文发现C组(130 mg/kg)注射药物后，由于大量药物对孕兔及其胎兔的毒性，导致8只孕兔流产，4只兔死亡，最终模型成功率为仅33.3%。B组(100 mg/kg)第1次注药后孕兔无流产及死亡，动物模型成功率为47.2%；在第2次给药后模型成功率提高至77.8%，但出现8只孕兔流产，并且流产后1只兔死亡。因此，应用100 mg/kg两次给药较130 mg/kg一次给药方法的模型成功率明显提高，而流产率及死亡率却明显的下降。由于孕兔的孕期较短(约30 d)，模型建立后可用于实验研究的剩余时间有限，可以选用其他孕期较长的动物制造糖尿病模型更佳，但需进一步探讨研究，而且费用会有所增加。通过本实验研究，应用ALX制备孕兔糖尿病模型，是一种相对经济、安全、可靠的方法，用小剂型多次给药的方法优于一次性大剂量给药，降低了流产率、死亡率，提高了模型成功率。