狐狸肉源性成分快速检测方法的建立

郑方媛 周秀雯 袁 望 冯 涛 李素芳 潘家荣

(中国计量大学生命科学学院/浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室/海洋食品加工质量控制技术与仪器国家地方联合工程实验室，浙江 杭州 310018)

肉类及其相关产品的掺假欺诈行为在世界各地屡有发生，影响消费者对食品安全的信心[1-2]。2013年，中国新闻媒体报道了一个犯罪团伙利用狐狸、水貂、老鼠等未经检验检疫的动物肉制品，添加明胶等伪造羊肉，非法盈利超过1 000 万元人民币[3]。2014年，全球最大的连锁零售企业沃尔玛因进货查验制度未落实到位，在标签为五香驴肉的产品中鉴定出狐狸DNA[4]。类似马肉丑闻[5]报道的事件不仅破坏企业的社会声誉，更会对经济、宗教、道德造成严重影响，甚至对消费者健康造成损害[6-7]。狐狸臭腺肉体通常不作为食用肉，流入市场会引起消费者不适甚至健康问题。针对肉类掺假严重的现状，迫切需要建立快速、可靠和特定的动物种类识别鉴定方法保护消费者免受这些恶意行为的侵害。

目前，肉源性成分的鉴定大多利用基于DNA 以及PCR 分析方法相关的技术，如实时PCR 技术[8]、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)[9]、物种特异性/常规PCR[10]或DNA 条形码[11]。Wu 等[6]以核DNA 为靶点，结合多重PCR和实时荧光PCR 技术，通过分析电泳带、扩增曲线和标准曲线，有效地鉴别了狐狸肉、貂肉、狗肉和兔肉成分，研究表明实时荧光定量PCR 检测结果具有线性良好(R2＞0.99)、重复性好等优点。Li 等[12]利用双重PCR 技术结合核酸内切酶消化，通过分析产物电泳长度，DNA 测序鉴定出牛肉和羊肉中1%(m/m)含量的狐狸、貂和浣熊成分。相对于基于蛋白检测的方法，常规PCR 法、实时PCR 法等基于核酸的检测方法具有稳定性好、特异性好、灵敏度高的优点。

交叉引物等温扩增( cross-primer isothermal amplification，CPA)是一种核酸等温扩增技术[13-14]，利用链置换型DNA 聚合酶可在60 min 内实现无温度循环的扩增，设备简单，在医学、流行病学和食品安全领域广泛用于病毒和病菌的检测[15-19]。横向流动试纸条技术(lateral flow dipstick，LFD)成本低且具有较高的特异性和敏感性，在检测致病细菌、蛋白质、重金属、真菌毒素和核酸方面起着重要的作用[20-21]，在肉源性成分检测方面大多结合PCR 扩增技术[22-23]。虽然目前已有多种扩增、检测方法用于肉源性成分的鉴定，但对于企业和监管部门来说，还缺乏准确、低成本、快速的现场检测方法，将等温扩增技术与核酸检测试纸条结合运用能有效满足现场快速检测的实际需求。

本研究利用CPA 技术与一次性核酸试纸条检测技术，以狐狸肉为研究对象，驴、羊、猪、鼠、鸭、牛肉为对照，以物种线粒体基因为靶标，用生物素和6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein，6-FAM)标记狐狸肉特异性CPA 引物，利用产物标记与试纸条胶体金、检测线物质的特异性结合建立狐狸肉源性成分快速检测方法，旨在为食品监管部门、肉制品加工企业、超市和消费者提供可靠的掺假检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狐狸样本(2 kg)由山东省济宁市嘉祥县养殖场提供，牛、羊、猪和鸭样本(各2 kg)购自浙江省杭州市物美大卖场(高沙店)，驴样本(0.5 kg)购于市场专营店，鼠样本(0.5 kg)为实验室留存样本。购买的样本均为新鲜的肌肉组织，将样本分装标记，置于-20℃冰箱储藏备用。一次性核酸检测试纸条[(disposable nucleic acid detection strip)，类型:D003-03，包装:10条/包×5]购自优思达生物技术杭州有限公司。

BstDNA 聚合酶(BstDNA polymerase，目录号:M0275S，8 000 U·mL-1)、MgSO4(100 mmol·L-1)，拜尔迪生物技术(北京)有限公司；液氮，杭州今工特种气体有限公司；西班牙琼脂糖(biowest agarose G-10)，米克化工仪器(杭州)有限公司。

由生工生物工程股份(上海)有限公司合成非标记引物[纯化方法: 高效亲和纯化(high affinity purification，HAP)]和标记引物[纯化方法:高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)]。提供动物基因组DNA 快速抽提试剂盒(目录号:B518221)、脱氧核苷三磷酸溶液(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs，目录号:B500056)、50×TAE 缓冲液(目录号:B548101)、DNA 分子量标准Marker A(25～500 bp，目录号:B600303)、DNA 分子量标准Marker C(100～1 200 bp，目录号:B600333)、1×TE 缓冲溶液(Tris-EDTA，目录号:B548106)、甜菜碱(Betaine，目录号:B106221，规格:100 g)、4S Red Plus 核酸染色剂(目录号:A606695)和双蒸馏水(ddH2O，目录号:A500197)。

1.2 主要仪器与设备

PICO 17 台式离心机、Nanodrop-2000 核酸蛋白分析仪，美国Thermo 公司；HH 系列数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司；Powerpac HC 1645052 伯乐高流核酸 电 泳仪，美国Bio-Rad 公 司； Tanson 3500 10T5553-825 凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；XH-C 漩涡混合器，江苏省金坛市白塔新宝仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 肉样品(驴、羊、猪、牛、狐狸、鸭、鼠)化冻后剔除肥肉、骨组织，各取80 g 剪碎的精肉标记备用。单一肉样品处理方式为从每种标记的精肉样本中取5 g 肉末，用研钵碾碎后标记用于提取DNA。羊和狐狸混合肉样品处理参考Abd El-Razik 等[24]的方法，在羊肉样品中加入狐狸肉，狐狸肉∶羊肉(m ∶m)为9∶10、8 ∶10、7 ∶10、6 ∶10、5 ∶10、4 ∶10、3 ∶10、2 ∶10、1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000、1 ∶10 000，分别取不同比例的混合肉样5 g用液氮处理后，用研钵磨成粉末标记备用。

1.3.2 DNA 提取 分别取每个单一肉种的研磨样品以及不同比例羊和狐狸混合肉的液氮研磨粉末样品各25 mg，参照动物基因组DNA 快速抽提试剂盒使用手册提取样品总DNA。提取的DNA 用核酸蛋白分析仪检测，并将其浓度调整约为100 ng·μL-1，-20℃保存备用。

1.3.3 引物设计 从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)检索狐狸、驴、鼠、羊、鸭、牛、猪的全线粒体完整基因组，利用DNAMAN 软件比对狐狸(GenBank 序列号:KP342451.1， NC026529.1， KP200876.1，KP050554.1)、 驴(GenBank 序列号: MK100122.1，MH605334.1，MG426188.1，KT221838.1 )、 鼠( GenBank 序列号: D83491.1，KY018919.1，AP014941.1，NC005089.1)、 羊(GenBank 序列号:KT148968.1， KU575248.1， KU681201.1，EF490456.1)、 鸭(GenBank 序列号: AF090337.1，NC028346.1，KT345702.1，KJ833586.1)、牛(GenBank序 列 号: AF492351.1，MF925711.1，MF663794.1，MG820631.1) 和猪(GenBank 序列号:NC012095.1，AP003428.1，AB298688.1，NC000845.1)的肉源内非特异性片段及肉源间特异性片段。选取物种内差异较小或一致的若干序列片段与其他6 个物种的线粒体区段再次比对完成狐狸特征性片段筛选，该区段基因为线粒体ND5 基因的一段序列。使用Oligo 7 和Primer 5 软件结合手工调整设计5 条狐狸的特异性引物(4s，5a，2a1s，2a*，3a*)(图1)，设计的引物序列在NCBI数据库中进行同源性验证。

图1 狐源特异性CPA 引物系统设计图Fig.1 The design diagram of fox specificity CPA primer system

1.3.4 产物检测方法 依据CPA 的反应原理图[14，25]，扩增产物为一系列长度不等的条带，本试验设计的狐狸特异性扩增体系扩增出最短的2 个产物分别为2a1s-3s-2s/2s1a-3a-2a(114 bp)，2a*1s-3s/2s1a-3a*(82 bp)，将这2 个产物作为电泳图的观测产物。将2a*1s-3s/2s1a-3a*(产物2)作为一次性核酸检测试纸条的检测产物，产物2 中2a1s-3a*标记为生物素，2a1s-3s*标记为6-FAM，检测产物被双标记(图2-A)。通过生物素与链霉亲和素的特异性结合，将带有生物素的产物与一次性核酸测试纸条的胶体金结合，荧光素与检测线上的荧光素单克隆抗体结合，在检测线上显示阳性，质控线区域含有生物素，与连有链霉亲和素的胶体金结合来指示试纸条的有效性(图2-B)。

图2 CPA 扩增及产物检测方法示意图Fig.2 Schematic diagram of CPA amplification and product detection methods

核酸电泳检测方法为在3%琼脂糖凝胶上以100 V 的电压对5 μL 扩增产物进行30 min 电泳，在凝胶成像系统上观察扩增条带。一次性核酸检测试纸条检测方法为取5 μL 扩增产物滴加于样品垫，将试纸条的样品垫向下插入含有100 μL 试纸条缓冲溶液的微孔板中，15 min 内拍照记录判读区的检测结果。

1.3.5 CPA 反应特异性测试 以狐狸肉DNA 作为阳性对照，鼠、鸭、牛、羊、猪、驴6 种肉的总DNA 和ddH2O 为参照。所有DNA 模板均使用1×TE 稀释至100 ng·μL-1。20 μL 的CPA 初始反应体系见表1，反应温度63℃，反应时间60 min。反应结束后分别取5 μL 扩增产物利用核酸电泳和一次性核酸检测试纸条进行检测。

表1 CPA 反应体系Table 1 The CPA reaction system

1.3.6 CPA 反应灵敏度测试 将保存的狐狸肉DNA样品(100 ng·μL-1)稀释至浓度为100、50、25、10、1、0.1 ng·μL-1，进行扩增灵敏度试验。反应产物用核酸电泳和一次性核酸检测试纸条分别进行检测，以确定CPA 反应体系对单一狐狸肉DNA 的灵敏度。

1.3.7 CPA 反应检测限测试 将狐狸肉与羊肉质量比分别为9 ∶10、8 ∶10、7 ∶10、6 ∶10、5 ∶10、4 ∶10、3 ∶10、2 ∶10、1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000、1 ∶10 000 的DNA(100 ng·μL-1) 作为模板进行CPA 扩增，产物用核酸电泳和一次性核酸检测试纸条进行检测。

2 结果与分析

2.1 CPA 扩增特异性试验结果

以狐狸、鼠、鸭、牛、羊、猪和驴肉DNA 为模板进行CPA 扩增试验，电泳结果见3-A。以ddH2O 为模板的阴性对照无扩增产物，说明反应系统自身不发生扩增；以狐狸肉DNA 为模板的反应产物在电泳图上显示核酸条带，最短的2 个条带长度与理论长度(2a*1s-3s/2s1a-3a*:82 bp，2a1s-3s-2s/2s1a-3a-2a:114 bp)相符，以鼠、鸭、牛、羊、猪和驴肉DNA 为模板的扩增结果中无CPA 特征条带。说明以狐狸DNA 设计的特异性引物系统只能扩增狐狸源性成分且具有良好的特异性。一次性核酸检测试纸条检测结果与电泳结果一致，说明一次性核酸检测试纸条能正确检测狐狸DNA的扩增产物。

2.2 CPA 扩增灵敏度试验结果

将狐狸肉DNA 浓度从100 ng·μL-1稀释至0.1 ng·μL-1，并用作CPA 反应的模板。电泳图在DNA 浓度大于10 ng·μL-1时显示阳性结果(图4-A)。一次性核酸检测试纸条在10 ～100 ng·μL-1浓度下显示阳性结果(图4-B)，在1 ng·μL-1浓度下阳性较弱，结果判读不可靠。因此检测狐狸源性成分的CPA 扩增方法灵敏度为10 ng·μL-1。

图4 狐源CPA 系统扩增灵敏度检测结果Fig.4 The sensitivity test results of fox source-CPA system amplification

2.3 CPA 扩增对混合肉的检测限试验结果

通过对羊肉和狐狸肉不同掺比混合肉提取的DNA 进行CPA扩增，确定了狐狸源特异性CPA检测体系的检测限，电泳图上观察灵敏度为9%(图5-A)。一次性核酸检测试纸条上观察到的灵敏度为1%(图5-B)。因此检测狐狸源性成分的CPA 综合试纸条法对羊和狐狸混合肉的检测限为1%。

图5 狐源CPA 系统扩增检测限结果Fig.5 The detection limit test results of fox source-CPA system amplification

3 讨论

特种毛皮动物(如貂和狐狸)的皮毛是高档纺织材料，不法养殖场为获取高额利润会利用激素加速动物生长或促成皮毛光鲜以获得更多更优质皮毛，大量剩余肉体低价出售给食品和饲料制造商，经过加工处理后进入市场，难以觉察。这些被丢弃或流入市场的肉体组织也容易成为很多病原体的宿主，如寄生虫[26]。因此，食用狐狸肉可能对人体健康造成危害甚至造成生命危险。目前肉类鉴定主要基于灵敏度高、准确性优、重复性好的PCR 检测技术开发研究，多选择羊、牛、鸭、猪等常见家养经济食用肉类作为研究对象[27-29]。本研究的主要目的是建立一种狐狸肉的快速检测方法，有助于保护消费者免受因食用含有狐狸肉食品而造成的伤害。

引物特异性设计是物种有效鉴定的前提[30]。本研究基于线粒体ND5 基因区域比对了各物种的种内种间差异，其中设计的狐狸3a*引物与其他物种的碱基差异比率范围为35%～88%，高于Kim 等[8]设计的牛特异性引物beef F 与其他19 个物种的碱基差异比率范围(30%～45.8%)。此外3′端多态性区域的差异比对分析也是特异性重要考量因素，在确证引物体系能有效扩增的前提下，CPA 方法中多引物参与、尤其是交叉引物的引入为狐狸的特异性检出提供了优势。本研究用5 种市售常见食用肉类以及可作为掺假肉的鼠肉作为对照验证了狐狸特异性CPA 引物系统的有效性。多物种同步检测开发是目前肉源物种检测的研究趋势[30-34]。在扩增层面，虽然包含5 条引物的CPA系统增加了对单个狐狸物种DNA 的特异性，但如果多物种特异性引物体系同步参与扩增，会受到多引物之间的选择或竞争性抑制，多个物种的扩增效率会有所不同，从而出现一个目标物种的检测产物优先扩增的情况[31，33]。在检测方法层面，目前多物种同步检测多利用膜高通量杂交系统[30]，鉴于市场检测对检测方法便携和快速的需求，后续研究将在此检测方法的基础上考虑多检测线试纸条配合多组抗原抗体标记的开发以应对多物种同步检测。

检测限和灵敏度是评价检测方法的重要指标，待检目标物、DNA 质量及检测方法均会对其产生影响。Abd El-Razik 等[24]通过将马肉或驴肉与牛肉混合，应用PCR 技术和电泳条带分析研究了牛粗加工肉与马、驴组织掺假的情况，其检出限为0.01%。Riztyan等[23]应用环介导等温扩增反应结合试纸条的检测技术对牛肉丸子中猪DNA 进行检测，检测限为0.01%。Qin 等[22]应用PCR 技术和试纸条快速鉴别掺假牛肉中的鸭肉，优化后体系检测到的检测限为0.05%。杨冬燕等[35]利用多重荧光PCR 鉴定羊肉掺假，检测限最低为7%。本研究结果发现，CPA 技术结合试纸条法对单一狐狸源性成分的灵敏度为10 ng·μL-1，对羊和狐狸混合样品的检测限为1%，综合市场肉品实际掺假现状，该检测限和灵敏度可基本满足需求。

CPA 技术具有响应迅速，设备要求低和操作容易的优势，尤其是对于易衰变且需在短时间内测试的样品具有较好的应用潜力。但该技术中复杂的引物系统容易导致非特异性扩增，引物二聚化，以及短条带的目标产物易导致气溶胶污染引起结果假阳性等问题。此外，该方法设计的狐狸特异性扩增体系配合核酸检测试纸条的检测方法对本试验6 种肉源以外的其他动物源性(如与狐狸亲缘较近的狗、貉等犬科动物以及更多种类的常见市场肉类)的特异性扩增试验有待进一步研究与填充，以适应更广的食品市场检测应用领域。

4 结论

本研究结果表明，依据狐狸源性特异性DNA 区段设计的CPA 等温扩增体系结合一次性核酸试纸条的检测方法对狐狸源性成分具有良好的特异性，且能够正确检测出狐狸和羊肉混合样品中的狐狸源性成分。交叉引物等温扩增技术结合一次性核酸试纸条检测方法可应用于动物源性成分的检测，对单一狐狸源性成分的灵敏度为10 ng·μL-1，对混合肉制品中最低狐狸源成分检出比例为1%。本方法可为等温扩增技术在狐狸源性成分鉴定方面的应用以及相关技术的研究和开发提供一定的参考，但在狐狸源性成分的微量/痕量检测方面还需进一步研究。