武夷菌素产品的创制与应用

葛蓓孛，施李鸣，张 维，杨淼泠，吕朝阳，张克诚

（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

关 键 字：武夷菌素；生物农药；高产菌株选育；田间应用效果

化学农药在防治农作物病虫害及保障粮食丰收方面发挥着重要的作用。但是，长期及过量使用化学农药不仅会导致病原菌产生抗药性，而且会造成农产品残留超标、环境污染等问题。因此，加速推进安全、高效且选择性强的生物农药的研制和开发势在必行[1,2]。

武夷菌素是由中国农业科学院植物保护研究所研制的一种具有我国自主知识产权的新型生物农药，具有低毒、高效、广谱、环保等特点，主要用于防治农作物真菌病害，对白粉病、灰霉病和黑星病等效果显著。武夷菌素先后获得“国家重点新产品”证书（2000G041B326001）和有机产品认证（COFCC-R-0903-0070），被列入国家蔬菜病虫害安全防治技术规范国家标准（NY/T5006-2001）和农业行业无公害蔬菜生产技术规程行业标准（NY/T5074-2002），成为我国无公害蔬菜和有机蔬菜生产中防治病害的重要生物杀菌剂产品之一，为绿色植保及农业可持续发展做出了一定的贡献[3]。

1 产品创制

1.1 产生菌及分类鉴定

武夷菌素（又称BO-10），是1979年在福建省武夷山上采集的土壤样品中依据微生物菌株代谢产物的抑菌活性、内吸性等标准筛选到的武夷菌素原始菌种，根据菌株的形态特征和生理生化特点，进行分类鉴定并命名为不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis[4]。后期经过分子鉴定和全基因组测序比对将其更名为小白链霉菌武夷变种S.albulus var.wuyiensis[5]。

1.2 理化性质及有效成分结构鉴定

武夷菌素粗制品经Sephadex-G-25柱层析、水洗脱等方法可制备成精制品，其中有两种不同有效成分武夷菌素a和b，其中a成分的含量占86%左右，b成分的含量为13%左右[6]。武夷菌素精制品经冷冻干燥后为微黄色的粉末，熔点为239 ℃，易吸湿、极易溶于水、微溶于甲醇、不溶于丙酮和氯仿等有机溶剂。主效成分a通过红外光谱、碳谱、氢谱分析，确定该组分的分子式C13H21N3O14，是一种含有胞苷骨架和过氧键的核苷类抗生素，经专利局查新证明，该化合物是一种结构全新、具有自主知识产权的新型农用抗生素[7]。此外，研究表明武夷菌素具有较强的抑菌活性，原因是其产生菌含有丰富的次生代谢产物，已分离鉴定出的活性组分还包含纳他霉素、丰加霉素、谷氏菌素、制霉菌素、ε-聚赖氨酸、苯甲酸、间苯二甲酸和黄酮类化合物等[8,9]。

1.3 作用机理

武夷菌素防治植物病原真菌的作用机制包括两个方面，一方面武夷菌素直接抑制病原菌生长以及分生孢子萌发。武夷菌素可使病原真菌分生孢子的萌发速度和产孢量显著下降，且菌丝生长变慢，分支增多、末端膨大、液泡数目增多；菌丝顶端出现原生质渗漏的现象，而芽管膨大、缢缩，影响真菌的亚细胞结构和细胞膜的渗透性；干扰菌丝体蛋白质、核酸及细胞壁几丁质的正常合成，从而起到抑菌的作用。另一方面，武夷菌素通过启动防御反应的相关信号途径，提高植物体内防御相关酶（如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶）的活性，进而提高植物自身的抗病性[9-11]。

1.4 毒性及安全性评价

武夷菌素的急性毒性试验结果为LD50＞10 g/kg体质量，属于相对无毒。蓄积毒性系数＞5，故无明显蓄积性。武夷菌素对大鼠最大无作用剂量为5000 mg/kg，无致畸、致突变效应。武夷菌素各项指标均符合国家卫生标准。

武夷菌素对环境生物的毒性和安全性评估结果为，蜜蜂LD50（48 h）＞5000 mg/mL；家蚕LD50（2龄）＞3226 mg/kg；斑马鱼LD50（96 h）＞89.92 mg/mL；鹌鹑LD50（7 d）＞100 mg/kg根据国家农药对环境生物的毒性及风险性分级标准，武夷菌素对蜂、蚕、鸟、鱼均为低毒[6]。

1.5 产品登记

通过极性溶剂与稳定剂筛选、多孔性载体吸附能力比较和助剂增效配伍等一系列技术措施，创制出1%水剂、2%水剂和3%可溶性粉剂武夷菌素系列产品（农药登记证号：LS981038、LS20083112。其中1%水剂获得农药生产批准证书，在中国 20多个省市（自治区）蔬菜、果树等作物上应用，推广应用超过 200万hm2。

2 高产菌株选育

2.1 传统育种技术

开展选育遗传性状稳定的高产优良菌株是提高菌株单位效价，降低生产成本，提升武夷菌素产业化生产水平和提高产品竞争力的关键环节。前期，采用传统的物理和化学诱变技术、原生质体融合等育种方法，获得了一系列在武夷菌素产量上比原始菌株有大幅提升的高产菌株。利用60Co-γ-射线和中子照射的M35和M46突变体作为亲本进行原生质体融合，选择营养标记互补的稳定的原养型重组子，获得高产菌株F31-24，效价比出发菌株提高了约80%[6]。以L7为出发菌株，采用不同剂量（500 Gy、1000 Gy和1500 Gy）的60Coγ-射线进行辐照诱变，成功选育遗传稳定性良好的菌株C-75，其效价较出发菌株提高34.4%。采用低能碳离子注入的方法，获得高产菌株F64（菌种保藏号CGMCC No.1967），效价可提高到6643 µg/mL，是出发菌株的2.5～3倍，发酵时间可缩短5～10 h[3]。传统育种虽能有效选育武夷菌素高产菌株，但存在随机性大、费时费力、易回复突变甚至还可能引入不利突变，无法实现精准的定向选育。

2.2 分子育种技术

基因工程育种相比传统育种具有专一性强、育种周期短、不易产生回复突变等优点，能够有效弥补传统育种的不足。近年来，已完成武夷菌素产生菌的全基因组测序，克隆武夷菌素生物合成基因簇，成功建立了高效遗传转化体系，解析武夷菌素生物合成途径及其关键调控机制[12]。研究表明，武夷菌素生物合成基因簇，包括22个结构基因和6个调控基因。其中，通过增加正调控基因wysR基因的表达量，可显著提高武夷菌素产量，发酵效价达到7215 µg/mL，较出发菌株提高26.5%[13]。由于微生物在次级代谢过程中往往受多个基因协调控制，单个基因的缺失可能会由其他基因在功能上进行互补，因此单基因的遗传操作具有一定的局限性。通常菌株体内含有复杂的代谢系统，很多同类型基因簇对前体的利用是相同的，因此他们之间存在相互作用[3]。武夷菌素产生菌中含有谷氏菌素、丰加霉素、制霉菌素、纳他霉素等其他活性成分。通过强启动子kasO*p强启动cluster5谷氏菌素生物合成基因簇的转运基因gouM，获得的菌株发酵液中武夷菌素产量较原始菌株提高了34.1%[14]。此外，通过敲除丰加霉素生物合成基因中影响武夷菌素产量的toyG和toyF基因，构建的toyF基因缺失突变株和toyG基因缺失突变株武夷菌素产量较野生菌株分别提高了23.06%和18.28%[15]。

3 发酵及提取工艺

采用响应面法优化了菌株F64的培养基配方和发酵条件，利用菌株F64和优化的培养基配方进行液体深层发酵培养，将有机碳源、有机氮源、速效碳源、无机氮源、无机盐以及水和菌株F64加入到发酵罐中，在28 ℃条件下进行二级发酵。培养条件为：一级发酵时间30～36 h，二级发酵时间48～56 h，接种量5%，罐压0.10 MPa，通气量1:0.9，搅拌转速180 r/min。采用高产菌株F64和优化的培养基配方发酵生产武夷菌素，节约发酵成本20%～30%[16]。

武夷菌素浓缩提取通常采用传统的薄膜蒸发法，但该方法会导致武夷菌素分解，收率仅为70%～80%。根据武夷菌素的结构特征（分子量443），设计发明了一种以人工生物膜为材料的“三膜组合”的浓缩提取方法，其原理是精滤膜和超滤膜分别去除分子量大于1500和800的大分子化合物，纳滤膜可截留分子量为 150～800的化合物，去除水分、无机盐等小分子物质。“三膜组合”法可在常温下浓缩提取武夷菌素，收率高达95%，不破坏武夷菌素的活性，且降低能耗、工艺简便，实现低碳生产[17]。

4 田间推广应用效果

武夷菌素对蔬菜、果树、粮食和经济作物真菌病害有很好的防效，如对白粉病、灰霉病、霜霉病、黑星病、枯萎病、流胶病、腐烂病等均有很高的防效，同时还具有一定的增产作用。

4.1 蔬菜病害的防治

武夷菌素对各种作物白粉病特别是黄瓜白粉病防效可达90%以上，防效与化学农药粉锈宁和百菌清相当。利用武夷菌素防治番茄叶霉病的防效稳定，能达到85%左右，防效超过化学农药速克灵和扑海因以及生物农药春雷霉素和多抗霉素。此外，武夷菌素对番茄灰霉病也具有较好的防治效果，其防效在 80%以上，好于化学农药速克灵，且武夷菌素和多抗霉素配合使用防效更佳[18,19]。

4.2 粮食作物病害的防治

利用武夷菌素防治大豆灰斑病防效可达到97.12%，同时，武夷菌素对大豆炭疽病、菌核病也具有良好的防效[20,21]。在四川蒲江进行的田间试验表明，武夷菌素对小麦白粉病的防效达到84.7%，略低于25%粉锈宁90.7%的防效，且武夷菌素对小麦叶锈病也有一定防效。此外，武夷菌素在控制玉米纹枯病中具有重要的应用潜力，其对玉米纹枯病生长具有显著的影响，菌落直径减少 75%以上，菌丝致病力下降99%[22]。

4.3 经济作物病害的防治

武夷菌素防治花卉病害，特别是月季花白粉病，效果理想，在黑龙江省大庆市和深圳的田间试验中，防效在85%左右；防治芦笋茎枯病效果明显，防效在80%以上；对茶树上的炭疽病、白星病、油菜菌核病、根腐病、白粉病等均有良好防效。利用武夷菌素防治西瓜枯萎病防效达 69.0%～85.7%，同时对西瓜炭疽病防效也较好。利用1%武夷菌素水剂200倍浸种24 h＋500倍喷根2次处理，能够有效地控制棉花黄萎病的发生，防治效果达到83.33%，显著好于多菌灵[3,23,24]。

4.4 果树病害的防治

武夷菌素对柑橘流胶病、疮痂病、溃疡病防效可达 90%～100%，同时对柑橘炭疽病、脚腐病、煤污病、树脂病也有很好的防效[3]。在老果园连续5年应用生物农药武夷菌素防治苹果腐烂病，其平均防效达86.2%，高出腐必治的防效 34%。它还是很好的防腐保鲜剂，对苹果、桃、梨、枇杷、葡萄、猕猴桃、龙眼、荔枝等水果上的真菌性病害均有很好的防效。利用 2%武夷菌素水剂对新疆厚皮甜瓜白粉病进行田间防效试验发现其防效达到60.17%。此外，武夷菌素对草莓白粉病、灰霉病、葡萄白粉病、霜霉病、白腐病等也有良好防效[3,25-27]。

5 展望

经过多年的研究和产业化生产应用，武夷菌素已成为我国无公害蔬菜生产中防治真菌病害的重要生物农药产品之一。随着全社会食品安全和环境安全意识的增强，武夷菌素作为一种高效、广谱的生物农药，具有广阔的发展前景。但在产业化生产过程中也存在许多问题，如需要重新办理正式登记、不断提高菌株效价、优化发酵工艺、研发更高效的提取工艺、创新武夷菌素产品新剂型及完善田间应用技术等。

今后研究工作将主要集中在以下几个方面：（1）加快推进正式登记办理。依据2017年修订后的《农药管理条例》相关要求，完善登记所需的毒理、残留、代谢等技术报告，尽快完成正式登记，继续为农业绿色生产做贡献。（2）提高菌株效价及优化发酵工艺。基于传统育种，综合利用基因工程和代谢工程技术，选育高产菌株，同时改进发酵工艺，实现各种发酵技术参数优化组合，从根本上降低武夷菌素的生产成本，促进产业化发展。（3）研发高效活性成分的提取技术。基于活性成分的理化特性，通过选择合适的柱材，组合高效分离制备、浓缩冻干技术等，并结合高效液相色谱，不断提高有效成分的含量，为研制武夷菌素产品新剂型奠定基础。（4）创新武夷菌素产品的新剂型。武夷菌素产品多为水剂形式，存在运输及储藏不便的缺点；武夷菌素粉剂产品中含有一定的糖分，储存过程中容易潮解结块。因此，需要进一步开发可湿性粉剂、颗粒剂、生物种衣剂、微胶囊剂等，提高储存时化学性质稳定性，降低加工和储运成本，提高药剂与作物黏附性，节约药剂施用的人力成本等。（5）建立武夷菌素的配套应用技术。针对不同作物和防治对象，开展包括最佳施药时期、施药浓度、施药间隔期及与其他生物防治产品配套使用的综合防控技术，解决单一生物农药难以在作物生长栽培周期防控多种病虫害的问题。