HPV16/18基因DNA存在状态与宫颈病变发展的研究

侯 任，卢 剑，杨晓宇，张为远

(1.桂林医学院附属医院，广西 541000；2.首都医科大学附属北京妇产医院，北京 100020)

宫颈癌是女性第四大常见恶性肿瘤及第四大因恶性肿瘤死亡的疾病，世界上每年有约569847例新患病例，约311365例女性死于该疾病。在经济欠发达地区，宫颈癌的死亡率仍仅次于乳腺癌位居第二[1]。高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomaviruss,HR-HPV)持续感染是高级别上皮内病变发生并发展为宫颈癌的主要和必需因素，据统计99%的宫颈癌与HPV感染有关，而HPV16和HPV18亚型感染是世界上最为广泛流行的两种高危亚型，分别导致了约70%的宫颈鳞状细胞癌及约90%的宫颈腺癌[2]。本课题组前期研究发现[3]，HPV16是导致北京市妇女宫颈病变恶性进展的最主要HPV亚型。HPV18是北京市妇女易感的5种主要HPV亚型之一，但与HPV16相比，其感染率较低。HPV是一种常见的小DNA双链病毒，HPV基因组中包含开放阅读框(open reading frame，ORF)的DNA编码链可分为3个区域，即早期蛋白编码区(early region，ER)、晚期蛋白编码区(late region，LR)，非编码区：长控制区(long control region，LCR)。早期区域编码8个开放阅读框，其产物E2、E6和E7均参与HPV DNA的整合调控。E2蛋白是一种调节蛋白，参与病毒DNA复制、游离基因维护和病毒转录，E2基因的断裂缺失和表达缺少解除了对E6、E7基因的抑制作用，导致E6、E7基因过度表达。而E6、E7蛋白分别通过与抑癌基因p53和pRb结合，导致p53蛋白和pRb蛋白失活，最终导致感染HR-HPV细胞持续增殖，是病毒基因发生整合的重要标志[4]。本文通过real-time PCR技术检测HPV16和HPV18两种亚型的DNA在宿主细胞中的存在状态，探讨这两种亚型感染与宫颈病变发生发展之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 156例石蜡标本取自2016年1月至2018年2月北京妇产医院妇科及肿瘤科。入选标准：年龄20～68岁；无全子宫切除史；无宫颈手术史；近两年内无妇产科检查和(或)药物治疗史；无盆腔放射治疗史；近3天无性生活的已婚女性。予以行宫颈液基细胞检查(ThinPrep liquid-based cytology test，TCT)后根据细胞学TBS-2014(the Bethesda system，宫颈/阴道细胞诊断报告系统)分类法诊断标准，提示为意义不明的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)及以上病变，包括低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)。经HPV快速导流杂交法(检测试剂及仪器由潮州凯普生物化学有限公司提供)分型检测明确为HPV16感染者132例，HPV18感染者24例。宫颈活组织检查提示宫颈炎症17例，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ级20例，CINⅡ级45例，CINⅢ级48例，宫颈癌(cervical cancer，CC)26例。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 DNA提取试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司；PCR扩增试剂盒购自美国ABI生物科技公司；RT-PCR仪选自美国ABI 7300 real time-PCR仪；引物、Taqman探针由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。

1.2.2 DNA提取 将宫颈活组织标本立即于10%甲醛固定液中固定24h，常规石蜡包埋，将石蜡包埋的标本切为5μm厚切片，取5片置1.5ml PE离心管，脱蜡、晾干。加DNA提取液，经孵育、震荡、离心、洗脱，提取DNA，溶于60μl游离水，-20℃储存备用。

1.2.3 实时定量PCR反应 采用实时定量PCR(real time PCR，RT-PCR)进行HPV16和HPV18型整合状态检测，分别扩增HPV16 E2和E6基因及HPV18 E2和E7基因。HPV整合状态的检测均在不知道细胞学或组织学结果的情况下进行，所用引物见表1，反应体系及反应时间按照试剂说明书进行。

表1 RT-PCR所用引物

1.2.4 HPV16和HPV18 E2、E6/E7基因扩增产物的半定量分析 绘制HPV16的E2和E6标准曲线及HPV18的E2和E7标准曲线。依据标准曲线计算机自动根据每一待检标本的扩增曲线所确定的E2和E6/E7的Ct值，计算各模板的E2、E6/E7起始拷贝数。通过E2/E6或E2/E7比值判断HPVl6和HPV18感染的体内状态：E2/E6或E2/E7比值接近或大于1为HPV感染游离状态；0

图1 HPV16不同存在状态的E2、E6 RT-PCR产物凝胶电泳图像N：阴性空白对照；1～2：HPV16游离状态；3～4：HPV16整合状态；5～6：HPV16混合状态

图2 HPV18不同存在状态的E2、E7 RT-PCR产物凝胶电泳图像N：阴性空白对照；1：HPV18混合状态；2～3：HPV18整合状态；4～5：HPV18游离状态

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0进行统计分析。应用χ2检验初步分析HPV16和HPV18各种存在状态对宫颈组织病变及细胞学的影响。应用比值比(odds ratios，OR)值和95%可信区间(95% confidence intervals，95%CI)用于描述HPV整合状态与宫颈病变的关联强度。所有统计为双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HPV16 DNA存在状态与宫颈病变的关系 HPV16阳性的132例宫颈组织中包括宫颈炎症组织11例，CINⅠ 15例，CINⅡ 40例，CINⅢ 48例，CC 18例。炎症组织中均未见整合形式的HPV16出现，均为游离型HPV16感染。游离型HPV16存在于各个级别的宫颈组织中，随宫颈病理学级别的升高，游离型HPV16的感染率逐渐降低，E2基因出现断裂的比率逐渐升高，但各组相比并无统计学差异(OR=0.625，95%CI=0.151～2.586，P>0.05，r=0.113)。游离和整合基因构成的混合型HPV16感染率随宫颈病变级别升高而升高，特别在CINⅢ和CC中，混合型HPV16感染率最高(39.6%和38.9%)。CINⅡ和CINⅢ组的混合型HPV16感染率有显著差异(P<0.05)，其他几组相比较无统计学差异(P>0.05)。各级别宫颈病变组相比较，HPV16完全整合率无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 HPV16 DNA存在状态与宫颈病变的关系

*P<0.05 vs CINⅡ

2.2 HPV18 DNA存在状态与宫颈病变的关系 HPV18阳性的24例宫颈组织中，宫颈炎症组织6例，CIN组织10例，CC组织8例。HPV18阳性的炎症组织中HPV常以游离形式存在(66.7%)，在宫颈病变的早期(CINⅠ)中病毒以完全整合形式的比率达60%，但在高级别宫颈病变中的完全整合率仅为20%，两者相比有显著差异(P<0.05)。8例CC组织中HPV18均以完全整合状态存在。所有研究组中，仅CINⅠ组中有混合形式的HPV18存在(20%)，而其他各组中HPV18仅以游离型和完全整合型的状态存在(表3)。

表3 HPV18 DNA存在状态与宫颈病变的关系

2.3 HPV DNA整合与宫颈细胞学改变的关系 纳入研究的宫颈细胞学为ASCUS及以上的HPV16/18感染的156例宫颈组织中，细胞学判读为ASCUS的病例35例，LSIL 47例，HSIL 74例。HPV16/18感染的宫颈脱落细胞中，多数HPV以游离形式存在于各级别的细胞学判读级别中，随着细胞学判读级别的升高，以游离形式的HPV所占比率从ASCUS的74.3%降至HSIL的52.7%(χ2=10.863，P<0.05)，完全整合形式的HPV并没有随着细胞学严重程度的增加而明显增加(χ2=0.090，P>0.05)；但是邻近的细胞学判读级别之间,HPV的3种存在形式均无统计学差异(表4)。

表4 HPV16/18基因存在状态与细胞学结果的关系

3 讨 论

宫颈癌是目前唯一可通过早期筛查及早期干预就能降低其发病率及死亡率的妇科恶性肿瘤。CIN的恶性进展是宫颈浸润癌发生的基础，但仍有约60%的CIN出现良性转归。临床上病理诊断为CINⅠ～Ⅱ，并不能根据形态学的改变来预测其发展的趋势。病毒基因整合于宿主细胞中，既往认为是HPV导致宫颈病变恶性进展的主要标志及关键步骤[6]。E6和E7蛋白与细胞周期调节蛋白相互作用，具有致癌能力。典型的病毒基因的整合过程是E2基因断裂，同时伴有E6/E7基因的过度表达。E6和E7都不具有内源性酶活性，但通过与宿主细胞蛋白的直接和间接相互作用而发挥作用，最终导致DNA复制过程的紊乱，促使HPV基因整合到染色体，造成宿主细胞的不稳定[6-7]。与此同时，E2基因断裂也参与调节细胞凋亡和细胞增殖的表达[8]。HR-HPV持续感染发展至宫颈高级别瘤变的风险较高，可能因病毒基因组以整合状态存在时，一方面难以被细胞免疫所清除，另一方面由于E2负调控蛋白的缺失增加了病毒癌基因的表达，这些因素均促进了病毒持续感染的发生[9]。

本研究中，CINⅠ组织中HPV16 E2基因断裂率为33.3%，并且完全以整合形式存在可达13.3%；HPV18感染的病例中，正常组织中完全整合率达33.3%。在宫颈病变早期发生的HPV整合状态，可能是在HPV感染的宫颈上皮细胞中，E6和E7蛋白的过表达明显增加了宫颈病变早期阶段的宿主细胞染色体畸变发生率，而导致宿主细胞发育不良[10]。这些发生染色体畸变的宿主细胞可存在于低级别病变甚至正常宫颈组织中，但成为宫颈病变恶性进展的前提。一项对428例宫颈HPV16阳性妇女进行跟踪随访研究显示，持续感染的HPV16常以整合形式存在，证实宫颈病变程度可能与病毒载量之间无显著相关性，而病毒与宿主基因组整合后，改变了基因的结构与功能，导致病变程度明显升高[11]。感染HPV16的CINⅡ+组织很少发生逆转为低级别病变的现象，而感染其他病毒的CINⅡ+组织可有40%发生逆转[12]。这与本研究相似，随着宫颈病变级别的升高，HPV16 E2基因出现断裂的现象逐渐增高，在CC组织中可达44.5%，但与已发生宫颈病变的各组组织相比，并无明显的统计学差异。可能是因HPV16的整合形式可形成一个超级增强子样的元件来驱动病毒癌基因的转录，并且超级增强子除了驱动E6/E7的高表达外，还能促进邻近基因的转录，提高了病毒感染的持续性[13]。这也可以解释在本课题组前期研究发现的HPV16在各个病理级别中的感染率均较高的现象[3]。

HPV18阳性宫颈病变组织的E2基因断裂情况比HPV16阳性常见，几乎所有的HPV18均以整合的形式存在于宫颈癌组织细胞中；HPV16感染的宫颈组织中，即使在CC中病毒也常以游离状态和整合状态的混合形式出现，而整合率并不高[14]。这与本研究结果相似，HPV16感染的宫颈癌组织中，以整合形式存在的HPV16占44.5%(包括混合型和整合型)，而在HPV18感染的宫颈癌组织中，病毒却全部以完全整合的形式存在。这可能是因为相较于HPV18 DNA，HPV16 3'LCR的甲基化水平较高，导致E2蛋白对E6和E7癌基因转录的负性控制丧失，使得在HPV16感染的宫颈癌组织中仍有游离的DNA存在，而在HPV18阳性组织中，E2基因断裂发生频繁[15]。推测在HPV16亚型感染的宫颈癌中，不仅仅因HPV整合这一个元素导致了宫颈病变的恶性进展，还可能与其他因素相关或协同作用有关。本研究还发现，HPV18感染的宫颈组织中，病毒的整合状态分别以33%及60%的比例出现在宫颈炎症组织和CINⅠ组织中，但CINⅡ+组织中仅占20%。这可能是因为HPV18型常与宫颈腺细胞癌相关，而腺细胞癌的发病率低，总样本量少所致；此外与HPV18相关的病变常很快地经癌前病变的窗口期而直接迅速进展为宫颈癌[16]，在宫颈病变CINⅡ阶段所能检测到的病例量不足。因此，感染HPV18可能更易导致宫颈细胞染色体的不稳定性，使得较快经过高级别宫颈病变期而侵袭致宫颈癌[17]。

不同亚型的HPV基因的生物学性状有很大差异，因此HPV16和HPV18感染的宫颈组织细胞中，不同病理级别中病毒的整合水平可能直接关系到病毒的传染性和持续感染性[18]。HPV16虽然常以游离的形式存在，但是传染性较高，持续感染时间久；HPV18的感染率虽很低，但却较快经过癌前病变期进入宫颈癌期。

在宫颈细胞学与HPV存在状态的研究中，宫颈细胞学为ASCUS的病例中有17.1%的整合状态的HPV16/18存在。这是病毒基因整合到宿主细胞作为宫颈病变的早期事件在细胞学的另一个体现。在各级别细胞学改变中均有游离或整合形式的HPV存在，这与之前学者得出的结论不同，在细胞学阴性或LSIL以下的宫颈细胞中只存在游离形式的HPV，而高级别的细胞学改变中没有单纯游离形式的HPV存在[19]。随着细胞学病理级别的增高，游离型HPV16/18的感染率逐渐降低(74.3%，61.7%，52.7%)，虽然病毒以游离的形式存在于宫颈病变的各个时期，但E2基因的断裂/消失情况逐渐增多。可见病毒癌基因的存在状态和表达可以作为评估宫颈病变恶性进展的辅助手段，从而有助于预测宫颈病变的进展[20]。

总之，HPV基因的整合会在宫颈疾病的早期进展过程中出现，而整合现象的出现并不是导致宫颈疾病恶性进展的独立危险因素，而是一个重要的分子生物学过程。病毒整合状态的检测比单纯HPV分型检测更有临床意义，整合状态的检测可作为一种生物标记用来预测宫颈病变的进展情况以用来评估宫颈恶性肿瘤发生的风险。不同的HPV亚型在致病的生物学和分子学性状有显著的不同，了解不同亚型的HPV基因存在状态对宫颈病变的规律有利于尽早准确判断宫颈病变的恶性进展风险，提高宫颈疾病的防治效率，指导临床治疗及随访策略的制定，对预防性疫苗的改良和新的治疗方法的研制也有着深远的意义，也必将成为预防领域的新视角。