宫颈细胞蜡块制作方法在宫颈病变筛查中的比较研究

苏讷敏，易驰喆，黄灵泉，张雪梅

（柳州市工人医院病理科，广西 柳州 545005）

子宫颈癌（cervical cancer）是妇科常见的恶性肿瘤，也是威胁亚洲妇女健康的第2 大恶性肿瘤[1]。宫颈液基细胞学检查方法的出现，为宫颈癌癌前病变及早癌筛查提供了重要手段。然而，液基细胞学检测易受主观影响，部分患者可能因非典型鳞状细胞（ASC-UC）被漏诊或因过度诊断而被分流至不必要的活检检查[2，3]，对其身体及心理均造成一定影响。研究显示[4]，利用宫颈液基细胞学标本制作成细胞蜡块能够有效收集细胞，对于液基细胞学可疑阳性的病例进一步进行免疫组化检测，可以协助提高诊断的准确性，为临床进一步分流患者提供可靠的依据[5-7]。传统的琼脂包埋法[8]是常用的细胞蜡块制作方法，顾维娜等[9]在传统方法的基础上进行改良，使细胞更加集中，通过放入温箱使琼脂凝固，取得了较好的制片效果（以下称琼脂温箱凝固包埋法），本研究在两者的基础上，优化凝固条件，保持细胞集中平铺，简化流程，旨在为后续的免疫组化及分子病理检测提供可能，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集柳州市工人医院病理科2018 年1月～12 月经宫颈液基细胞学检查（TCT）剩余细胞学标本270例，其中经组织活检诊断为炎症、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL），鳞状细胞癌（SCC）的病例分别为148例、35例、72例、15例。

1.2 方法 将检测剩余的宫颈液基细胞样本平均分为3 份，倒入对应编号的离心管中，以2000 rpm 离心10 min 收集细胞，分别用传统琼脂包埋法、琼脂温箱凝固包埋法、琼脂冷冻凝固包埋法进行细胞蜡块制备。3 种细胞蜡块制备完成后均进行常规切片，HE 染色，由2 位高年资病理医师共同阅片诊断。

1.2.1 传统琼脂包埋法 用吸管吸取上清液弃掉；取60 ℃3%琼脂1 滴滴入离心管中，摇动使琼脂与细胞充分混合，将离心管置于4 ℃冰箱20 min；待混合液呈凝胶状后取出，用包埋纸包好，按常规石蜡包埋制作细胞蜡块。

1.2.2 琼脂温箱凝固包埋法[9]用吸管吸去大部分上清液，余留高于沉渣1 cm 的液体，混匀细胞悬液；将一滴60 ℃3%的琼脂滴在胃镜包埋盒的小槽中，使琼脂均匀铺满小槽内，并置于60 ℃温箱2 min；吸取全部细胞悬液于包埋盒的小槽，放置温箱4 min；待细胞沉渣凸面变为凹面时，在胃镜包埋盒的小槽内再次滴加琼脂，直至覆盖沉渣表面少许，再次将包埋盒放入温箱2 min；包埋盒置于冰箱冷冻仓冷冻3 min后，将琼脂块取出，用包埋纸包好，按照常规石蜡包埋制备细胞蜡块。

1.2.3 琼脂冷冻凝固包埋法 吸取1 滴滴入60 ℃3%的琼脂滴在小号包埋盒中，使琼脂均匀平铺于包埋盒，置于冰箱冷冻仓3 min，使琼脂凝固；用吸管吸去离心管上清液，将细胞沉渣吸出尽可能平铺于凝固的琼脂中心后在包埋盒中再次滴加琼脂至刚好覆盖沉渣完全，包埋盒放入冰箱冷冻仓3 min 后，将琼脂块取出，按照常规石蜡包埋制备细胞蜡块。

1.3 观察指标及评价标准 比较3 种方法制片效果、诊断阳性率及诊断的符合率。细胞学：参照《子宫颈细胞学Bethesda 报告系统》（第2 版）标准。组织学：依据2014 年第4 版WHO 女性生殖器官肿瘤分类标准分为：炎症、低级别低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）及鳞状细胞癌（SCC）。以活检组织学诊断为金标准，以发现高级别鳞状上皮内病变及鳞状细胞癌为阳性。

1.4 统计学方法 数据使用SPSS 19.0 软件分析，计数资料使用[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蜡块及切片制作效果

2.1.1 肉眼观察 利用传统琼脂包埋法制作的细胞蜡块因细胞与琼脂混杂，细胞较分散，肉眼观组织轮廓不清晰，琼脂温箱凝固包埋法及琼脂冷冻凝固包埋法所制的细胞蜡块因细胞沉渣被琼脂包裹于中心，细胞较集中，组织轮廓清晰，见图1。

2.1.2 显微镜下观察 传统琼脂包埋法细胞较分散，背景混杂琼脂无定型物，每张切片能够观察到的细胞较少，另外两种方法制成的切片细胞相对集中，观察细胞数量较多，其中琼脂冷冻凝固包埋法较琼脂温箱凝固包埋法细胞更加集中和平铺，所观察的细胞数也更多，见图2。

图1 三种细胞蜡块制备方法蜡块及切片肉眼观

图2 三种细胞蜡块制备方法的HE 染色切片显微镜下形态

2.2 操作过程及用时 传统琼脂包埋法操作简单，但琼脂及细胞混合物凝固时间较后2 种长；琼脂冷冻凝固法相对琼脂温箱凝固法操作步骤简单，用时较短。

2.3 筛查阳性率及诊断符合率 3 种方法每组各270例标本，细胞蜡块制作均满意，TCT 及3 种细胞蜡块制备法诊断阳性率分别为25.92%（70/270）、24.44%（66/270）、27.41%（74/270）、30.00%（81/270），3 种细胞蜡块制备方法诊断阳性率分别与TCT 结果相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 种方法与其诊断符合率分别为86.67%（234/270）、92.59%（250/270）、95.93%（259/270），与后2 种细胞蜡块制备法相比，传统琼脂包埋法诊断符合率较低，差异有统计学意义（P＜0.05），琼脂温箱凝固包埋法与琼脂冷冻凝固包埋法与组织病理诊断符合率较高，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 TCT、三种细胞蜡块制备法以及组织活检结果（n）

3 讨论

目前对于宫颈癌前病变的筛查最常用的方法是液基细胞学检查，因其取材简单，操作方便，易于观察被临床广泛使用[10]，然而对于部分可疑阳性的病例，临床处理过程中，部分患者被建议3～6 个月后复查，部分被分流至宫颈活检及进一步行免疫组化检测协助诊断，极易漏诊或过度处理[11]，同时对患者身心都造成一定影响，因此有必要探索一种既能在早期提高宫颈病变筛查的准确率，又操作简单便捷的方法，如何充分有效利用细胞学标本显得尤为重要。液基细胞的保存有一定的时限性，且需要耗费的资源及成本较高，研究显示细胞蜡块技术可弥补这一缺陷，并且有助于提高细胞病理学诊断的敏感性和特异性[12]。将TCT 剩余标本制作成细胞蜡块，能够收集更多刷取的脱落细胞，实现组织学重构，便于反复、连续切片，并为进一步免疫组化及分子检测提供可能，为细胞学诊断提供更多依据，大提高了细胞学诊断及分流的时效性及可能性。

宫颈液基细胞不同于胸腹水具有纤维蛋白网罗细胞的功能，宫颈液基细胞标本细胞含量较少且较为松散，制作细胞蜡块时细胞沉渣的收集及取出比较困难。文献报道的传统琼脂包埋法[8]是在离心管内滴加琼脂，将细胞沉渣及琼脂混合后取出混合物。本研究发现在滴加琼脂的过程中，细胞沉渣被琼脂冲散，琼脂与细胞混合物不易成形、细胞分散、不易成团、切片时细胞难以处于同一平面，导致可观察的细胞数较少，同时镜下易出现琼脂无定型物背景，影响观察及诊断。顾维娜等[9]报道的琼脂温箱凝固包埋法相比传统琼脂包埋法，采用琼脂上下包裹细胞，使细胞聚集在一定范围内，易于观察切片。然而本研究发现采用温箱蒸发凝固胃镜包埋盒中平铺的琼脂时，由于水分的蒸发，琼脂表面会凹凸不平，局部下陷，再将细胞放入琼脂表面时，也将造成细胞分布层次不一，影响切片观察，并且整个操作过程步骤较多，较费时。

本研究在上述琼脂温箱凝固包埋法的基础上，经过改良，优先快速冷冻凝固底层琼脂使其产生一个平面，将细胞沉渣平铺于琼脂平面上，保证了细胞团块的集中和平整，有利于切片，可以减少蜡块修整导致的细胞含量损失，后将表层琼脂覆盖并快速冷冻凝固，易于将琼脂块整体取出，切片后细胞量多，集中、平铺，制片效果好，且操作过程简单省时，是一种较好的宫颈细胞蜡块制备方法。

对细胞蜡块诊断数据分析显示：TCT 及3 种细胞蜡块制备法诊断阳性率分别为25.92%、24.44%、27.41%及30.00%，差异无统计学意义（P＞0.05），提示细胞蜡块对于宫颈病变筛查阳性率与TCT 结果相仿，可以作为除TCT 外的选择，并通过后续免疫组化及分子病理检测进一步对病变进行分流，这一结论与朱勇等[12]的研究结果一致。此外，与后2 种细胞蜡块制备法相比，传统琼脂包埋法与组织活检诊断符合率较低，琼脂温箱凝固包埋法与琼脂冷冻凝固包埋法与组织病理诊断符合率较高，差异无统计学意义（P＞0.05），提示经过改良后的2 种琼脂凝固包埋法均较传统琼脂包埋法有助于提高诊断的准确率，虽然2 种改良后的方法在诊断准确率上无明显差异，但琼脂冷冻凝固包埋法在操作便捷及用时方面优于琼脂温箱凝固包埋法。

综上所述，可以考虑将宫颈液基细胞蜡块制备技术作为TCT 替代方案，不仅可以提高早期宫颈病变筛查的准确性，同时也为部分需要进一步明确诊断的患者提供了检测机会，如通过对细胞蜡块P16及Ki-67 表达情况可以早期发现宫颈高级别上皮内病变，避免不必要的创伤性活检及漏诊，为患者节约了检测成本，减轻了患者身心负担。琼脂冷冻凝固包埋法是一种较好的宫颈细胞蜡块制备方法。