核酸适配体在环境与食品检测中的应用进展

佟雨珊, 高志贤, 周焕英, 闫宏远

(河北大学公共卫生学院， 河北保定 071002)

1 前言

核酸适配体是一段DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)序列，通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的能够与转移配体特异性结合的单链寡核苷酸序列〔1-4〕。核酸适配体这一概念最初是由Ellington和Szostak提出的〔1〕，而后Ellington利用SELEX技术成功筛选出了能够与汽巴克隆蓝、活性蓝4特异性结合的RNA，命名为aptamer。 核酸适配体可以由人工合成，与靶物质特异性结合，具有与抗原-抗体反应类似的高亲和性和高特异性〔5〕，因此又被人们称为“化学抗体”。但实际上核酸适配体在很多性能方面超越了抗体，具有很多独特的优点如可进行体外筛选、应用范围广泛、对靶分子具有极高的分辨率、对实验具有极高的重复性、精确性和纯度、便于保存等优点，近年来已成为检测领域的一项新的热点，已经被广泛应用到食品安全、环境监测、生物组装、药物递送、信号转换等多个领域。本文主要就核酸适配体近几年在环境和食品检测方面的应用进行总结、探讨和展望。

2 核酸适配体在食品安全检测中的应用

食品安全问题一直是人们关注的焦点，是衡量人民生活质量、社会发展水平和国家经济建设的一个重要方面〔6〕。然而日益加剧的食品安全问题也在很大程度上给人们带来了严重的危害。近年来，世界范围内食品安全事件频发，食品安全俨然成为一个引起全球性关注的焦点问题。从我国近几年出现的食品安全抽检不合格的情况可以看出，我国食品安全问题主要集中于致病菌、重金属、生物毒素、农药兽药等几个方面。针对食品中有害污染物，发展简便快捷、灵敏可靠且高通量的现场快速检测新技术是进一步加强食品安全工作的重要保障〔7〕。近年来，核酸适配体技术的快速发展引来了越来越多的学者关注，纳米科学在食品安全检测领域有着巨大的潜能。

2.1 致病菌的检测致病性细菌直接或间接污染食品和水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。常见的是食品致病菌有痢疾杆菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺菌、金黄色葡萄杆菌、致病性链球菌等。目前一些传统的检测方法多是采用微生物培养、平皿计数等，这种方法还需要培养、分离，比较费时费力，检测速度慢、效率低。近年来逐渐兴起的DNA探针、核酸适配体技术也加入到食品安全检测的队伍中，这种技术选择性高、特异性强，针对不同的致病菌有不同的适配体，结合电化学传感器可实现快速、简便、可靠的检测手段，具有很高的重现性、稳定性和准确性〔8〕。 2011年Li〔9〕等筛选出大肠杆菌K88毛蛋白的核酸适配体以来，核酸适配体用于大肠杆菌的检测已成为研究的热点。Wu〔10〕等人使用了大肠杆菌O157:H7外膜特异性的两个不同的适配体。其中一个适配体用于磁珠富集，另一个作为该病原体的信号报告体，用等温链置换扩增(SDA)扩增，并进一步用横向流动生物传感器检测，检测到O157:H7大肠杆菌低至10个菌落形成单位(CFU)。不需要提取DNA，减少了处理和更简单的设备要求，使该检测方法成为一种简单和快速的传统方法的替代。Zhang〔11〕等基于核酸适配体特异性识别技术和纳米离子增强拉曼信号原理，构建了对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行同时检测的拉曼核酸适配体生物传感器，最低检测限达15，35 CFU/ml。

2.2 毒素的检测毒素是由生物体产生的，极少量就能引起人和动物中毒的一种物质。按来源可分为动物毒素、植物毒素、微生物毒素。微生物毒素又分为细菌毒素、真菌毒素和单细胞藻类毒素。毒素对食品安全的各个环节危害极大，加强对其检测很有必要〔12〕。其中真菌毒素最为常见，广泛分布在农作物中，通过食物进入人体，引起各种中毒症状。 Zhisong Lu〔13〕等人利用核酸适体探针及其互补的ssDNA修饰金纳米粒子，构建了一个基于DNA折纸的黄曲霉毒素B1检测平台，为DNA折纸技术在多种小分子检测中的应用开辟了新的视野。Cruz-Aguado〔14〕等筛选出一条针对赭曲霉毒素A的单链DNA适配体，用具有很高的特异性，可用来建立多种检测方法检测农产品中的赭曲霉毒素A。Qian〔15〕等人基于AuNPs在还原剂存在下促进AgNPs化学沉积，结合DNA适配体的碱基互补原则构建了一种双通道多功能比色检测技术，利用双氧水催化TMB显色反应使其具有更高的吸光度，并用以检测黄曲霉毒素B1。他的这种方法操作简单、成本低、省时省力，在初筛中具有很好的应用前景。

2.3 药物残留的检测食品中的药物残留包括植物产品中的农药残留和动物产品中的兽药残留，Kim〔16〕等利用DNA适配体固定化金电极芯片，建立了一种用于化学传感的电化学检测方法。当17beta-雌二醇与DNA适配体相互作用时，结合的雌二醇干扰了亚铁氰化物和亚铁氰化物氧化还原反应产生的电子流，电流降低。在阴性对照实验中，由于其他化学物质的存在，电流仅轻微下降。Liu〔17〕小组根据目标分子和分子信标竞争结合核酸适配体的原理，设计了一种三螺旋开关，由两条带有特定序列的DNA探针及目标物适配体形成一种发夹结构，当目标物啶虫脒存在时，结构发出荧光，当啶虫脒不存在时，荧光发生猝灭。该方法证实检测线性范围是100～1200 nmol/L，并成功应用到卷心菜样品中。许景月〔18〕等以核酸适配体作为识别元件、以插入型染料噻唑橙作为信号元件构建了一种非标记核酸适配体传感器检测四环素。在最优反应条件下,该核酸适配体传感器对TET进行检测的线性范围为0.05-1000 μg/m L,检出限为0.022 μg/m L。这种非标记核酸适配体传感器对食品中的其他兽药残留、乃至其他有害物小分子均具有很好的应用前景。

3 核酸适配体在环境卫生检测中的应用

在经济快速发展的时代背景下，环境污染恶化问题也逐渐显露出来，当我国从农业大国向工业强国转变的时候，越来越多的工业活动对自然界生态环境产生着不可逆的改变，全球变暖、土壤沙化、水资源污染、空气质量下降等都成为世界范围内不可忽视的重要方面。在环境保护问题上，我国始终走在世界前列。面对这些近在咫尺的环境问题，对工业废气、废水进行有效的检测检验，保证企业处理废水、废气达到国家允许排放的标准显得尤为重要。

3.1 重金属检测在各种环境污染中，重金属污染已经成为最严重的环境生态污染之一，某些有毒重金属对人体危害极大，同时又属于累积性污染物，需要格外地引起重视。DNA适配体技术在重金属检测中有很大的发展。 Liu〔19〕设计了高选择性识别Pb2+和Hg2+的DNA探针，与凝血酶连接的适配体探针(TBA)5’端和3’端分别标记荧光供体羧基荧光素和荧光受体4-〔4-(二甲胺基)苯基偶氮〕苯甲酸，TBA在溶液中保持一个自由的线状结构，当加入靶标物Pb2+和Hg2+后构相发生改变，这种构相的改变，使两端的荧光基团和猝灭基团之间发生荧光共振能量转移荧光强度下降，通过这种荧光强度的变化选择性的检测Pb2+和Hg2+，检测最低浓度达到300 pmol/L和5.0 nmol/L，可用于土壤Pb2+和水中的Hg2+的检测。 Li〔20〕等发现不同金属离子与单标记核酸链的结合动力学存在差异性 ，首次根据其动力学特征来区分不同的金属离子，将一端标记羧基荧光素的核酸链作为荧光探针，利用Cr3+的荧光猝灭动力学特征来检测湖水中的Cr3+。该方法为核酸适配体在金属离子的检测中提供了新的思路。 袁敏〔21〕等设计了一种基于核酸适配体的电化学生物传感器来检测Cd2+，由于适配体与Cd2+有特异性结合能力，当镉离子存在时与核酸适配体互补链竞争结合适配体，根据电化学信号的变化来进行检测。此方法对Cd2+的线性检测范围为1.0 nmol/L～10.0 μmol/L，检出限为65.1 pmol/L，是一种灵敏度高、特异性强的快速检测方法，在镉环境污染监测方面具有良好的应用前景。

3.2 农药残留检测随着农业生产的高度发展农药广泛使用，土壤、水环境中也容易出现残留的农药污染物，这些经过污染的水体不止存在自然界中，也会影响到我们的日常生活。目前核酸适配体的高特异性高灵敏度的分析检测能力在环境安全监控中发挥着重要作用。 Bala〔22〕等将有机磷农药的适配体与纳米金连接形成一种光学传感器，当目标杀虫剂存在时，适配体构象改变，纳米金颗粒聚集，溶液颜色发生改变，不仅肉眼可辨，检测限可低至0.01 nM，且具有极高的特异性，当存在其它干扰物质时也可选择性的识别磷酸盐，从而成功应用于实际样品的检测。但农药的种类繁多，我们生存的环境中需要检测的农药也并不单一，一种物质上可能存在好几种农药，高通量检测是趋势也是必然。2020年Liu〔23〕等研究建立了一种基于广谱适配体的有机磷农药比色检测方法可以对不用类型的有机磷农药进行分析检测，在最优条件下，该方法可有效检测50～1000 ng/ml的异碳磷和100～500 ng/mL的氧乐果。这种广谱适配体可以实现农药残留的高通量检测。

4 展望

目前，科技经济的巨大发展为实现快速灵敏高效的检测提供的更大的平台，核酸适配体作为分子探针在检测领域已经取得了一定的成果，其可塑性远远不止于此。随着针对不同分子靶标的核酸适配体的出现，更多的基于核酸适配体检测方法与检测平台也将被设计出来，也将产生更多高灵敏高特异性的检测手段。相信随着科技的不断发展和广大科研工作者的不懈努力，核酸适配体将在食品安全、环境监控、医学诊断等领域发挥更大的作用。