骨肉瘤相关基因甲基化研究进展

武太勇，李 健，付海军，程才统，吕 智，冯 毅

（1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西医科大学第二医院骨科，山西太原 030001）

骨肉瘤起源于间叶细胞，是一种最常见于10～30 岁人群中的原发骨恶性肿瘤疾病，多见于长骨干骺端，具有侵袭性强、易转移等特点。目前，骨肉瘤治疗的方法主要包括手术配合放化疗，但存在复发、转移、耐药等问题［1］。骨肉瘤的发生、发展机制尚未明确。骨肉瘤的早期诊断对患者的预后至关重要，但早期诊断却相对局限，主要包括影像学检查和血清生化等检测，并且其特异性和敏感度普遍不高。

DNA 甲基化因其稳定性且易于定性或定量检测，是早期发现癌症的一个重要诊断指标。甲基化是表观遗传改变的重要方式，在多种癌症中能够发现异常的DNA 甲基化［2，3］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基化转移酶的催化作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′C 位的共价键结合一个甲基基团；DNA 甲基化是基因表达调控、基因沉默和选择性基因剪接的重要机制之一，是癌基因激活和抑癌基因失活的重要原因之一［4，5］。 其作用机制分为两种：一种是甲基化后的DNA 不被某些转录因子识别，所以无法结合到该基因的启动子，从而引起转录抑制；另一种是甲基化后的DNA 召集甲基化结合蛋白，使该基因的启动子区发生甲基化，进而引起目的基因转录失活。可见，DNA 甲基化在癌症早期发挥重要作用。因此，本文综述骨肉瘤相关基因甲基化，为阐明骨肉瘤的发生、发展与耐药机制提供新的方向，同时为骨肉瘤的早期诊断、预后预测、研究靶向药物治疗提供科学依据。

1 PTEN 基因甲基化与骨肉瘤

第10 号染色体缺失的同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphataseand tensin homolog，PTEN）是常见的肿瘤抑制基因之一，是调节细胞增殖和分化的因子，其特征主要与本身脂质磷酸酶活性有关；骨肉瘤的发生、发展与PTEN的下调有关［6，7］。PTEN调控肿瘤细胞的增殖、凋亡主要通过以下三种信号转导通路发挥作用：（1）PI3K/AKT 信号通路；（2）MAPK 通路；（3）FAK 通路。同时，PTEN能够提高caspase-3、7、9 活性，从而诱导骨肉瘤细胞的凋亡。研究发现，在癌症中PTEN基因发生甲基化，导致PTEN表达缺失，从而加速肿瘤的生长和转移，如：骨肉瘤、宫颈癌、膀胱癌等［7-9］。 Song 等［10］将甲基化抑制剂5-Zac 加入MG-63 骨肉瘤细胞中，发现mRNA 表达水平增加，PTEN的表达水平增加，细胞出现凋亡现象，同时PTEN的甲基化水平降低，且随着5-Zac 浓度的增加，PTEN表达和mRNA 转录水平逐渐升高，细胞凋亡率也与5-Zac 浓度呈正相关。Wang 等［11］同样证实了骨肉瘤中PTEN因甲基化导致表达降低，同时开发了亚硒酸盐取代羟基磷灰石纳米粒子（selenite-substituted hydroxyapatite ，SeHA），利用离子取代理论，采用共沉淀方法得到纳米级的SeHA 晶体，将晶体与细胞共同培养，发现SeHA 能够明显抑制细胞存活，存活率下降（58.90±14.37）%，而HA 的抑制作用稍弱，细胞存活率仅下降（11.58±9.33）%。在骨肉瘤裸鼠模型中，该颗粒能显著抑制骨肉瘤复发，从而延长生存期。虽然并未发现SeHA 纳米颗粒对PTEN有去甲基作用，却证明了HA 可以提高该基因的甲基化水平，从而降低了PTEN的表达，提示掺杂亚硒酸根离子对PTEN基因具有去甲基化作用。综上，可以认为PTEN基因甲基化与骨肉瘤细胞的增殖、凋亡密切有关，PTEN甲基化能够影响PTEN的转录和翻译，从而影响PTEN基因参与的信号通路对肿瘤细胞的调控，进而促进肿瘤的增殖。在去甲基化处理后，能够去除部分甲基化位点的甲基，使PTEN发生去甲基化，能够一定程度上恢复其抑癌作用。因此，将含有SeHA 的生物材料应用于骨肉瘤患者是一项比较有意义的发现。

2 Wnt 信号转导通路相关基因甲基化与骨肉瘤

Wnt 信号通路与多种肿瘤的发生与发展有关，是一条复杂的调控网。目前认为，Wnt 信号通路主要有以下3 个分支：（1）经典Wnt 信号通路，即Wnt/β-cantenin 信号通路；（2）Wnt/PcP 通路（planner cell polarity pathway）；（3）Wnt/Ca2+通路。多种癌基因和抑癌基因通过调控Wnt 信号转导通路，影响肿瘤疾病的发生、发展。

2.1 APCDD1 基因甲基化与骨肉瘤

结肠腺瘤样息肉下调蛋白1（adenomatosis polyposis coli down-regulated 1，APCDD1）是一种与Wnt 途径相关的膜蛋白，是Wnt/β-cantenin 信号通路的抑制剂，其本身受β-cantenin 转录调控。研究发现，APCDD1 在结肠癌、非小细胞肺癌和肾母细胞瘤等疾病中异常表达［12］。Han 等［13］研究发现，骨肉瘤组织的APCDD1启动子区域的DNA 甲基化水平明显高于邻近正常组织，且表达明显低于正常组织；在骨肉瘤细胞系中，APCDD1启动子区的DNA甲基化同样显著高于成骨细胞。在给予去甲基化处理后，APCDD1的表达恢复，发挥抑癌作用。根据国内外文献报道，APCDD1的过表达能够使下游靶基因E-Cadherin，c-Myc和cyclinD1的表达均降低，从而负调控Wnt 信号通路，同时APCDD1能够抑制骨肉瘤细胞上皮间充实转换和转移。APCDD1的异常表达在多种肿瘤中存在，APCDD1甲基化在骨肉瘤的发生、发展中起着重要作用，为骨肉瘤的发病机制的研究提供一种方向。

2.2 Wnt5a 基因甲基化与骨肉瘤

Wnt5a 是研究最广泛的Wnt 家族Wnt 蛋白之一，在各种器官的发育过程和产后细胞功能中起着重要的作用。它是一种分泌性糖蛋白，根据细胞受体环境，与Fz 和Ror 1/2 受体结合，导致Wnt 信号通路发生抑制或激活。 Wnt5a 通过非典型Wnt RhoA/Rac 或钙（Ca2+）信号通路参与细胞的调节，Wnt5a 在多种癌症疾病中发现被错误调节［14］。Vaidya 等［15］认为Wnt5a 因具有不同亚型蛋白，所以对通路发挥激活或抑制具有不同的表现。Wnt5a基因通过选择性剪接和不同的转录起始点产生多个转录本。目前，已有8 个人类Wnta 转录本，其中有3个能够产生完整的蛋白。实验发现，与正常成骨细胞相比，骨肉瘤SaOS-2 和U2OS 细胞中Wnt5a启动子B 活性降低，且在Wnt5a启动子B 的CpG 区发现了甲基化。经过甲基化抑制剂5-Zac 处理后，SaOS-2 细胞的启动子B 被活化。综合上述，研究表明，Wnt5a亚型B 作为抑癌因子在Wnt 信号通路中发挥重要的抑制作用，调控着骨肉瘤的发生、发展，是骨肉瘤中一个比较有指导意义的抑癌基因。Wnt5a启动子B 活性降低是由DNA 甲基化与组蛋白共同作用所致。国内外对此基因研究较少，仍有很大的研究空间。Wnt5a作为Wnt 信号通路上重要的抑癌基因，后续不论是应用于诊断还是治疗的道路仍漫长。

2.3 SFRP2 基因甲基化与骨肉瘤

分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled-related proteins，SFRPs）是一种能够抑制Wnt 信号转导通路的蛋白，通过经典和非经典途径负调控Wnt 信号转导通路［16］。截至目前，已检测到有5 种人类SFRPs，它们都拥有一个富含半胱氨酸的结构域（CRD），用以与Wnt 配体结合。近年来，越来越多的证据证明SFRP2是一种肿瘤抑制基因，SFRP2的高甲基化及其低表达与多种肿瘤疾病相关，例如前列腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌等［17］。Xiao 等［18］研究发现，在骨肉瘤标本中SFRP2表达降低且基因启动子区甲基化增加，在骨肉瘤细胞中使用甲基化抑制剂5-Zac 处理之后，观察到SFRP2发生去甲基化，且基因恢复表达，并且能够抑制骨肉瘤细胞的侵袭作用。同时，发现能够抑制β-catenin 在骨肉瘤细胞中的核保留。结合上述研究，SFRP2与骨肉瘤的发生、发展有关，其主要是通过负调控Wnt 信号转导通路，是Wnt 信号通路激活拮抗剂；甲基化使其失活，在经过去甲基化处理后，能够恢复SFRP2的抑癌作用，其可以作为治疗的靶点之一，能够为药物的研究提供理论依据。然而，由于缺少体内实验验证，因此需要进一步的深入研究。

2.4 miR-370 甲基化与骨肉瘤

FOXM1（forkhead box protein m1）是FOX 家族的一员，其主要功能是作为转录因子进行调节细胞的增殖、分化、细胞周期进程、DNA 损伤修复以及凋亡相关基因的表达。FOXM1 参与MAPK 通路和Wnt/β-catenin 通路，FOXM1 能够与β-catenin 相互作用，并促使后者核定位，且当FOXM1-β-catenin 复合物进入细胞核时，能够进一步与T 细胞因子（Tcf）或淋巴增强因子（Lef）形成转录复合物，进而激活c-myc和cyclinD1等Wnt 靶基因的表达［19］。许多microRNAs 在骨肉瘤的发病机制中起着重要的作用，例如：miR-17-5p、miR-26a-5p、miR-34a、miR-135b、miR-150 和miR-203 等［20-24］。根据它们在骨肉瘤疾病中发挥作用不同，将其分为致癌miRNAs 和抑癌miRNAs。例如，在骨肉瘤细胞中，miR-34a 和miR-203 表达减少，发挥肿瘤抑制作用；相反，miR-135b 和miR-150 在骨肉瘤样本中过表达，发挥致癌作用［23，24］。包括miR-33b、miR-124a 和miR-127 在内的几种抑癌miRNAs 可以被DNA 甲基化修饰，从而导致在不同癌症疾病中表达下调；miR-370 能够直接靶向FOXM1 的3′非翻译区，从而抑制其表达［25］。Zhang 等［26］证实，在骨肉瘤细胞中miR370 因DNA 甲基化表达降低，导致FOXM1 过表达，最终使骨肉瘤细胞中的Wnt/β-catenin 信号激活。使用甲基化抑制剂AZA 能够显著抑制FOXM1 的表达，提示miR-370 表达降低是因为DNA 甲基化所致。由此可知，miR-370 作为Wnt 信号通路重要的关键因素，甲基化使其低表达，去甲基化处理后使其恢复表达发挥生物学功能。因此，深入研究此靶点对骨肉瘤治疗具有重要意义。

2.5 WIF-1 基因甲基化与骨肉瘤

WIF-1（Wnt inhibitory factor-1）是Wnt 家族的成员之一，是Wnt 信号转导通路的抑制剂，能够与WNTS 结合，从而阻断WNTS 与受体蛋白复合相结合，阻断经典和非经典Wnt 信号转导通路［27］。段飞等［28］证实在骨肉瘤中Wnt-1 的启动子区域发生甲基化，在给予裸鼠动物模型加入5-氮杂-2'-脱氧胞苷去甲基化处理后WIF-1表达增高，重新抑制肿瘤。充分说明，WIF-1的甲基化是参与骨肉瘤发生发展的机制之一，WIF-1通过经典和非经典Wnt 信号通路发挥作用，去甲基化能够重新使其发挥抑癌作用，这为骨肉瘤机制的研究提供丰富的内涵。

3 ARHI 基因甲基化与骨肉瘤

ARHI又称为DIRAS3（GTP-binding protein Di-Ras3），是Ras 超家族中的一员，是一种肿瘤抑制基因。现已证实，ARHI表达的缺失与多种肿瘤疾病的发生、发展有关［29］。有研究证实，ARHI基因甲基化能够抑制其表达及活性，多种癌症中ARHI的表达缺失是因为DNA 发生甲基化而引起下调，ARHI甲基化可能参与恶性肿瘤的发病过程［30］。Ye等［31］研究发现，与正常样本比较，骨肉瘤细胞中ARHI基因的表达明显降低，ARHImRNA 的表达也明显减少，其启动子区域发生了明显甲基化。Zebularine 是一种新型去甲基化药物，其成分为胞苷类似物，与5-氮杂-20-脱氧胞苷等其他DNA 甲基化抑制剂不同，Zebularine 在体内和体外有较高的稳定性和较低的毒性，并且Zebularine 能够抑制ARHI甲基化，从而促进人骨肉瘤细胞凋亡［31］。综上，ARHI基因是一种抑癌基因，在骨肉瘤中发挥重要作用，因甲基化而失活，从而促进骨肉瘤的发生；5-氮杂-20-脱氧胞苷具有药物毒性，在使用方面有一定的局限性；目前，Zebularine 在细胞实验中已充分证实其作用，但尚未在体内实验中验证，期待能早日得到验证并应用于临床治疗，为骨肉瘤患者带来福音。

4 BMP-2 基因甲基化与骨肉瘤

骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是BMP 家族蛋白之一。到目前为止，共发现20 个BMP 蛋白，有14 个在成骨细胞分化中具有很强的作用。其中，在所有的BMP 蛋白中，BMP-2 最活跃且具有较强的成骨能力，属于转化生长因子β（TGF-β）超家族［32］。BMP-2 在早期的胚胎发生、骨骼发育以及成骨细胞成熟分化过程中起重要作用，它能够通过诱导结构蛋白的表达来刺激成骨细胞的增殖，从而诱导骨形成，例如：Run相关转录因子2（RUNX2）、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素等［32］。Chen 等［33］研究发现，在骨肉瘤组织中发现BMP-2 高表达，在给予干扰BMP-2 的表达后能够明显抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。也有研究证实，在骨肉瘤MG-63 细胞系中BMP-2 呈高表达［34］。BMP-2 能够通过Wnt/b-catenin 信号通路促进骨肉瘤细胞的EMT，从而促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭［32］。BMP-2基因启动区域甲基化能够抑制其表达，从而导致骨质疏松症的发生［34］。在骨性关节炎疾病中，BMP-2 甲基化能够诱导Smads 与Sost 启动子CpG 区亲和力的改变，从而调节骨关节炎软骨细胞中Sost 的表达［35］。翁艳等［36］发现，与正常组织、良性病变组织相比，骨肉瘤组织中BMP-2基因低甲基化，故认为BMP-2基因启动子区甲基化程度与骨肉瘤的发生、发展有关，BMP-2基因甲基化的改变导致BMP-2 蛋白的表达失衡，进而影响骨肉瘤的发生发展。结合国内外研究发现，由于BMP-2甲基化研究较少，对于骨肉瘤中BMP-2 蛋白的高表达是否是因为低甲基化所致的关系尚不明确，仍需深入研究。同时，对原发性骨肿瘤在使用BMP-2 相关治疗或相关生物材料应用时，应注意BMP-2 能够促进骨肉瘤的发生、发展。

5 STAT3 基因甲基化与骨肉瘤

STAT3 是一种DNA 结合蛋白，是STAT 蛋白家族中重要的成员，在信号转导和转录激活中起着重要作用，进而影响多种细胞类型的细胞的生长和凋亡［37］。STAT3 像STAT 家族其他蛋白一样，在细胞暴露、细胞因子和生长因子中被激活。激活后，STAT3 能够从细胞浆移位到细胞核中，并与靶基因的启动子结合到特定的序列上，从而调节基因转录［38］。STAT3 在多种癌症疾病中起着重要作用，在脑部肿瘤疾病中起着致癌或抑癌作用，这取决于肿瘤的突变性质，STAT3 的激活能够促进骨肉瘤的发展［39］。Xu 等［40］研究发现，在骨肉瘤样本中，STAT3高度甲基化，其认为STAT3基因甲基化可能影响STAT3 的表达，进而参与了骨肉瘤的发展。STAT3是多个信号转导通路的枢纽，其通过基因甲基化与其他蛋白相互作用，在骨肉瘤中发挥作用。STAT3甲基化在骨肉瘤中的文献较少，具有局限性，仍需进一步的研究与验证。

6 结语

目前，骨肉瘤的治疗是世界难题之一，其发病机制尚不清楚，转移及耐药机制也未明确；其主要发病人群是青少年，并且大多数病人在初次诊断时已发生了肺部转移，给个人、家庭、社会带来巨大的健康问题和经济负担。近些年，骨肉瘤临床治疗研究进展缓慢，在骨肉瘤病因学和生物学方面上的理解与临床治疗结果的改善仍存在较大的差距。甲基化是表观遗传改变方式之一。虽然国内外研究癌症的基因甲基化比较多，但对骨肉瘤相关基因甲基化的研究则甚少，而且大部分是在组织和细胞系的验证及研究，并未与临床相结合，体内研究则很少涉及，临床研究尚无报道，故存在一定的局限性和可靠性。骨肉瘤发病机制及基因组学非常复杂，并非一个基因或一条通路就可以解释清楚，也并非基因甲基化可以完全阐述清楚，但是基因甲基化可以作为关键点进行研究，对早期诊断、基因治疗、生物材料应用、药物研究等具有十分重要的意义。目前，虽然根据DNA 去甲基化治疗的机制，去甲基化药物decitabine（5-aza-DC）和azacitidine 已用于治疗血液系统恶性肿瘤，但是由于对基因甲基化在肿瘤发生中的具体作用机制没有系统及深入的理解，导致在临床上众多癌症中的应用具有较大难度与风险。骨肉瘤癌基因与抑癌基因是如何在骨肉瘤疾病中发生、发展过程中起作用，以及如何产生耐药，都需要深入研究。因此，以基因甲基化为基点进行深入研究，不仅能够为阐明骨肉瘤疾病的发生提供理论依据，同时希望能够在骨肉瘤临床与科研中提供新的方向。