诱导多能干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

范佳俊，王君杰，陈烽，陈哲

(1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第二医院，浙江 杭州 310005)

脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤平面以下自主运动和感觉的丧失[1]。流行病学调查显示，全世界平均每年每百万人中有40～80人发生脊髓损伤[2]，其中年轻人占比较大[3]。Edwin Smith早在公元前2500年就认为该病是“不可治愈且不值得治疗的”[4]。目前尽管各种治疗手段较之前取得了一定进展，但疗效仍不能令人满意，至今仍没有一种普遍被接受且治疗效果显著的方法用来治疗该病[5-6]。近年来，随着再生医学的发展，尤其是干细胞技术的发展和应用，脊髓损伤的治疗也有了新的方向。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)是由分化的体细胞经过重编程而产生的多能干细胞，兼具干细胞的多种优点，有着近似胚胎干细胞的自我更新能力和分化潜能。目前，IPSCs已成为国内外干细胞研究领域的热点。本文就IPSCs治疗脊髓损伤的研究进展综述如下。

1 脊髓损伤的概述

脊髓损伤可分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。原发性脊髓损伤是由外力直接引起的，通常导致神经组织的变形、撕裂，甚至神经轴被切断，这些损伤往往是不可逆的。脊髓损伤后，短时间内(几分钟)病变部位开始出血，引发血管痉挛、血栓形成以及脊髓水肿[7]。可见，脊髓损伤主要是神经损伤和血管结构损伤。在原发性脊髓损伤后，继发性脊髓损伤开始出现，并将持续几分钟至几个月不等[8]。脊髓损伤后脊髓组织出现水肿，血脑脊髓屏障会被破坏，随后内皮细胞和星形胶质细胞发生变性，神经胶质瘢痕增生[9]。胶质瘢痕增生在脊髓损伤后3 d开始，并在约28 d后达到稳定[10]。最终，脊髓受损区域内轴突再生的过程会被提前增生的胶质瘢痕阻断。硫酸软骨素蛋白多糖是一种与胶质瘢痕增生相关的神经轴突生长抑制分子，也参与了抑制病变区脊髓的再生[11]。

2 IPSCs的产生和生物学特性

治疗脊髓损伤的重点在于修复、重建损伤的脊髓，以及恢复运动、感觉和自主神经功能[12]。神经元是成人中枢神经系统再生的关键细胞，它能启动新的轴突生长，并最终建立新的突触连接[13]。轴突的再生需要5个步骤：第1步，从损伤区进行逆行的信号转导；第2步，将信号输入细胞核；第3步，轴突生长必不可少的分子转录和翻译；第4步，轴突自身生长；第5步，轴突突触形成[14]。干细胞移植可以为受损区域提供充足的外源性神经元，建立脊髓再生的基础条件，这为脊髓损伤的治疗开启了新的篇章。神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells，NS/PCs)已被证明是所有候选细胞中较为理想的供体细胞[15]。获取NS/PCs的经典方法是使用胚胎干细胞。由胚胎干细胞衍生分化而来的NS/PCs具有修复受损脊髓，促进脊髓损伤模型动物功能恢复的能力[16]。然而，源自人的胚胎组织或胚胎干细胞因涉及伦理问题而受到限制，甚至在某些国家已经明确表示禁止使用[17]。为了解决无法使用胚胎组织的这个问题，Yamanaka将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4种转录因子转染到小鼠体细胞中，结果发现小鼠的体细胞经过这4种因子的诱导后产生了逆分化现象，形成了多能干细胞，即为IPSCs[18]。这些诱导生成的多能干细胞显示出与胚胎干细胞相似的特性，同样具有多重分化能力。干细胞经历分化后，基因被选择性表达，形成具有特定功能的体细胞，但这些细胞本质上并没有改变自身遗传物质。IPSCs的制备过程就是将分化的细胞在特定条件下逆转，使之拥有无限生长的能力，同时又保持多能性。IPSCs在形态、蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体及畸形瘤生成、分化能力等方面均与胚胎干细胞相似。IPSCs能分化为所有胚层细胞，分化出成体动物的所有组织和器官。这种源自体细胞的IPSCs不仅解决了伦理问题，而且若细胞来源于患者自身，在临床使用过程中还可以避免免疫排斥的问题。

3 IPSCs移植治疗脊髓损伤的研究现状

目前，越来越多的研究团队将IPSCs应用于脊髓损伤的治疗，并证明了其有效性。Tsuji等[19]用小鼠IPSCs引导分化后形成神经球，并将神经球移植到脊髓被挫伤9 d后的小鼠脊髓损伤区，结果显示这些源自IPSCs的神经球成功地分化为3个细胞谱系，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，从而促进了小鼠运动功能的恢复。Nori等[20]将成年人成纤维细胞作为供体细胞来建立人类诱导多能干细胞(human-induced pluripotent stem cells，HIPSCs)，并将这些HIPSCs衍生的神经球移植到非肥胖型糖尿病联合严重免疫缺陷的小鼠脊髓中治疗脊髓损伤，结果显示HIPSCs衍生的神经元和受损区域中的小鼠神经元之间形成了突触连接，而且直至实验结束时(脊髓损伤后112 d)仍可以观察到小鼠运动功能的恢复。Kobayashi等[21]通过使用HIPSC-NS/PCs来治疗狨猴脊髓损伤，结果证明了IPSCs在灵长类动物脊髓损伤模型中同样有效，这使得人们更加相信IPSCs未来可以用于治疗人类的脊髓损伤。Fujimoto等[22]的研究表明，实验小鼠运动功能的恢复是由被移植的神经元和存活的内源性神经元共同参与完成的，2种类型的神经元均通过形成突触连接并整合神经元回路来重建皮质脊髓束。

由于脊髓损伤分为急性损伤和慢性损伤，所以并不是所有的研究在将IPSCs用于治疗脊髓损伤时都能取得令人满意的结果。我们查阅了近10年来所有关于HIPSCs移植治疗脊髓损伤的动物实验研究，其中近90%的实验研究是在脊髓损伤的急性或亚急性期，即脊髓损伤后14 d内移植了HIPSCs。但是否在脊髓损伤的急性期移植HIPSCs就一定有效，目前尚存争议。Nutt等[23]从一位86岁的男性身上取体细胞建立了HIPSCs，在实验大鼠脊髓损伤后第14天将其移植到免疫缺陷的脊髓损伤大鼠体内，并通过组织学观察，从受伤区域的白质及灰质中发现了新生的轴突。Lu等[24-27]报道，在脊髓损伤的慢性期(脊髓损伤4周后)使用HIPSCs进行细胞移植治疗，组织学结果均显示脊髓内有新的轴突形成。尽管组织学结果令人满意，但研究人员并未观察到受伤大鼠的神经功能有任何恢复。Lu等[24-25]报道，将HIPSCs移植到脊髓损伤大鼠体内后，并没有观察到大鼠下肢功能的显著改善。Okubo等[26-27]的研究结果显示，虽然HIPSCs移植治疗的时间间隔是最长的(脊髓损伤后42 d)，但均观察到大鼠下肢神经运动功能明显得到改善。Yousefifard等[28-29]荟萃分析结果显示，IPSCs移植治疗可以改善脊髓损伤大鼠的运动功能，脊髓损伤后治疗间隔时间越短后期功能恢复越好。

此外，有学者考虑将手术中极易获得的椎间盘细胞作为IPSCs的供体细胞。Oh等[30]研究报道，在小鼠脊髓损伤后9 d，将来自椎间盘组织的IPSC-NS/PCs移植到小鼠脊髓中，结果显示小鼠的后肢功能得到明显改善。这说明椎间盘这种以前一直被认为在手术中切除后只能被丢弃的组织，有望成为脊髓损伤替代疗法的自体细胞来源。

4 IPSCs移植治疗脊髓损伤面临的问题及解决方法

4.1 免疫排斥问题及解决方法免疫排斥问题是IPSCs移植治疗脊髓损伤的首要安全问题。自体细胞被诱导生成IPSCs并达到移植条件所需时间至少6个月[17]，这将错过脊髓损伤治疗的最佳时期。因此，使用已生成和测试过的临床特征良好的同种异体IPSCs则更可行。但是，使用同种异体IPSCs移植治疗脊髓损伤，必然会产生免疫排斥问题。

Pomeshchik等[31]报道，对脊髓损伤实验大鼠仅给予他克莫司作为免疫抑制药物，不仅远期生存率较差，而且大鼠下肢运动功能恢复也未得到任何改善。而Romanyuk等[32]报道，将HIPSC-NS/PCs移植到脊髓损伤大鼠体内后，给予环孢素、甲基泼尼松龙和硫唑嘌呤钠等多种免疫抑制药物，最终有大鼠存活了下来，且移植的细胞最终分化为中间神经元、多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元和运动神经元。综上，我们认为IPSCs可以在免疫抑制的病变区域内存活并发挥作用，但应当服用合适的免疫抑制药物。

4.2 长期安全性问题及解决方法IPSCs移植治疗脊髓损伤的长期安全性是另一个值得考虑的问题。Nori等[33]报道，在成人真皮成纤维细胞中转染Oct4、Sox2和Klf4因子，建立IPSCs细胞系并将之诱导形成神经球后植入脊髓损伤小鼠体内，这些神经球最终分化为3种谱系的神经细胞，在移植47 d后可见小鼠运动功能恢复；然而，到移植103 d时，由于移植区出现了肿瘤，最终导致小鼠运动功能恶化。IPSCs移植治疗脊髓损伤面临的长期安全性问题是IPSCs有致瘤性。因此，我们认为在采用IPSCs移植治疗各种疾病之前，需要建立高度安全可信的IPSCs。IPSCs导致的肿瘤大致可以分为2种类型：一种是畸胎瘤，成熟畸胎瘤通常是一种良性疾病，它由多种不同的组织如皮肤、毛发、牙齿、骨骼、油脂和神经组织等组成；另一种是实质性肿瘤，极有可能向恶性发展，向外周侵袭甚至转移[34]。

目前，畸胎瘤的形成机理尚未完全明确。近些年的研究表明，未分化的IPSCs仍是导致畸胎瘤形成的原因[35-36]。未分化的IPSCs具有与肿瘤细胞一样的不受限制的分化能力，通过改变MHC-1、Fas或Trail突变来逃避免疫反应，使其可以在宿主中不受限制的分化，从而形成畸胎瘤[37]。Okubo等[35]研究发现，使用γ-分泌酶抑制剂(gamma-secretase inhibitor，GSI)阻断Notch信号通路，可以诱导未分化的HIPSC-NS/PCs在体外分化为成熟的神经元细胞；通过基因表达谱发现，GSI能促使神经元成熟的标记基因上调，而与细胞繁殖和自我更新相关的基因标记物下调；通过组织学观察发现，经GSI处理的脊髓损伤区域中有成熟的分化神经元，而未经GSI处理的脊髓损伤区域中细胞呈肿瘤样过度生长。因此，去除未分化细胞及降低细胞增殖能力可能是防止畸胎瘤形成有效手段。畸胎瘤的形成还与供体细胞的组织来源有关。Miura等[38]报道，用成人不同组织生成的IPSCs进行移植，发现畸胎瘤的形成倾向有很大差异；来源于胃上皮细胞的IPSC-NPCs没有肿瘤形成倾向，而来自成年小鼠尾尖成纤维细胞的IPSCs具有较高的肿瘤形成风险。这表明IPSCs的供体组织不同，其移植后畸胎瘤形成的风险也不同。

但是，有研究[33-34]发现，即使清除了所有未分化的细胞，在移植区域仍能发现实质性肿瘤。因此，阐明这些肿瘤的发生机制就显得更加重要。与良性畸胎瘤相比，实质性肿瘤通常是恶性的，它们有随时侵袭或扩散到身体其他部位的可能。这些肿瘤发生的主要机制包括基因组不稳定性和表观遗传不稳定性[39-40]。引起基因组不稳定的因素有3个方面原因：第一，IPSCs形成时使用了逆转录病毒或慢病毒等整合载体。这些载体可以很容易将目的基因整合到细胞原有的基因组中，但这种整合是非定向的，这也就造成了在整合过程中可能会破坏细胞正常的抑癌基因并形成肿瘤[41-44]。使用GSI预处理移植细胞并使用非整合型仙台病毒载体，可降低HIPSCs衍生细胞的肿瘤形成率，并提高HIPSCs衍生细胞移植治疗的安全性[44-45]。因此，我们建议使用不干扰基因组的无整合方法转染重编程因子，以避免因基因整合引起的致瘤性。第二，Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4个转录因子在各种自然形成的癌症细胞中也会高表达。有报道表明，在40种癌症类型中有18种癌症细胞至少过表达一个重编程基因[46]。第三，成熟的体细胞经历多次分裂并存活很长一段时间才能获得遗传突变。在正常情况下，由于不再繁殖复制，这些突变对肿瘤形成的影响微乎其微。但是，如果细胞处在不断的分裂繁殖期，这种微小的突变就会因为多次复制而被放大，就可能会促使肿瘤形成[47]。除了基因组的不稳定性外，表观遗传不稳定性在肿瘤发生中也起着重要作用，尤其是DNA甲基化。Iida等[34]报道，癌基因甲基化不足的IPSC-NS/PCs更容易形成肿瘤。

5 小 结

IPSCs作为一种理想型的来源细胞，为未来应用于临床治疗脊髓损伤带来了希望，但是临床应用时仍需克服一些问题。首先，要考虑的是肿瘤的形成。通过IPSCs的终末分化，使用无基因整合方法以及建立可靠的移植细胞克隆来降低肿瘤发生的风险[48]。还可以利用自杀基因，特异性地去除移植区内尚未分化的增殖细胞来降低肿瘤发生的风险；但是，自杀基因在去除这些细胞后还会影响已经具有运动功能的细胞，这会严重影响实验动物运动功能的恢复。其次，免疫抑制剂的使用仍是现阶段乃至未来建立短时间内获取安全可靠的自体IPSCs方法之前，解决免疫排斥问题的优选方案。未来的研究应更加集中于慢性脊髓损伤的治疗，为IPSCs移植治疗脊髓损伤打通最后的难关。相信随着学者们对IPSCs认识及在移植调控方面研究的不断深入，IPSCs在脊髓损伤修复中的应用前景将更加广阔。