基因疗法治疗nAMD的相关临床试验及前景展望

张玮 综述 颜华 审校

天津医科大学总医院眼科 300052

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)患者多为50岁以上人群，双眼先后或同时发病，视力进行性损害，是发达国家老年人群的主要致盲眼病之一。据估计，2040年AMD人数将达到2.88亿[1]。伴随着人口老龄化的发展，AMD的发病率、患病率将逐年升高。新生血管性年龄相关性黄斑变性(neovascular age-related macular degeneration，nAMD)又称湿性AMD，主要特点为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成[2]。虽然nAMD患病人群的比例明显低于干性AMD，但却是90%以上AMD患者视力下降，甚至视力丧失的主要原因[3]，因而对nAMD患者进行早期干预和及时治疗尤为重要。

1 nAMD的治疗方法

目前，nAMD的治疗方法主要是抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和激光治疗。抗VEGF药物包括哌加他尼钠、贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普和Brolucizumab等，患者往往需要重复注射，不仅增加经济负担，也增加了玻璃体腔内注射带来的严重并发症[4]。许多nAMD患者抗VEGF药物治疗后效果欠佳，主要原因为：(1)CNV病灶反复活动，导致视网膜水肿、渗出及出血，影响视力；(2)出现局部组织纤维化或萎缩，损害视功能[5]。激光治疗包括传统的激光光凝、光动力疗法和经瞳孔温热疗法，其只对已形成的CNV有效，不能阻止早期AMD的发展，仅限于晚期AMD的治疗[6-7]。

虽然抗VEGF疗法为目前nAMD的主流治疗方法，但其只靶向新生血管生成，并不能抑制nAMD其他致病通路的激活，如氧化应激、炎症反应等[8]。此外，抗VEGF治疗后复发率较高，不能解决nAMD持续性活动的问题，因而亟需寻找一个长效、持续、缓释的临床治疗方法[9-10]。近年来，基因疗法的广泛应用为nAMD的治疗带来了更多可能。通过延长治疗间隔，其可进一步提高疗效并降低治疗成本[11]，还可靶向nAMD多个发病机制的位点。基因疗法在动物实验中显示出的良好效果，促使其治疗nAMD临床试验的进一步开展，探寻其安全性和有效性。

2 基因疗法治疗nAMD的机制

基因疗法通常以腺病毒(adenovirus，Ad)、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)或慢病毒作为载体[12]，将目的基因cDNA与载体组合，利用病毒感染宿主细胞的特点，实现目的基因在宿主细胞内的表达。不同的是，Ad、AAV不能整合，而慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组中，具有更稳定的转基因能力[13]。基因疗法通常使用玻璃体腔内或视网膜下注射的方法将药物导入病变组织，实现内源性蛋白在眼中的持续表达，达到抑制CNV形成和发展的目的[14]。

3 不同基因治疗nAMD的临床试验

关于nAMD的基因疗法，早期靶点为色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)、可溶性VEGF受体-1(soluble VEGF receptor 1，sFlt-1)、内皮抑素和血管抑素、ADVM-022、可溶性CD59(soluble CD59，sCD59)等，均进入临床试验阶段，结果显示安全性较好[14]。随着基础研究的深入，动物实验的成功施行为基因疗法治疗nAMD的临床试验带来了更多可选择的靶点，如缺氧诱导因子、血小板衍生生长因子[15-16]等。以下就PEDF、RNA干扰(RNA interference，RNAi)、sFlt-1、内皮抑素和血管抑素、抗人VEGF抗体片段、sCD59、阿柏西普、GT005基因治疗nAMD的临床试验逐一介绍。

3.1 PEDF

PEDF是眼中的强血管生成抑制剂，最初在人类胎儿视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞中检测到，在血管生成、神经保护、纤维生成和炎症反应等各种生理和病理机制中发挥至关重要的作用[17]。

早在2001年，Rasmussen等[18]分别在鼠激光诱导的CNV模型、VEGF转基因模型及早产儿视网膜病变模型中，证明了1×108～1×109颗粒单位(pu)的Ad(GV)PEDF可显著抑制新生血管形成，抑制率高达85%，该研究促使了首个基因疗法治疗nAMD临床试验的进行。2006年，Campochiaro等[19]发布了28例晚期nAMD患者的Ⅰ期临床试验(NCT00109499)结果，患者接受单次玻璃体腔内注射表达人PEDF的E1、E3、E4部分缺失的Ad载体(AdPEDF.11)，剂量范围为1×106～1×109.5pu，结果显示未见严重的剂量限制性毒副作用或与药物相关的不良事件，25%的患者出现轻度、短暂的眼内炎症，6例患者的眼压升高，可通过局部用药控制，所有Ad培养均为阴性。剂量高达1×109.5pu的AdPEDF.11安全且耐受良好，Ⅰ期临床试验着重于药物安全性的评价，由于缺少随机对照，无法得出AdPEDF.11的疗效性结论，但其结果潜在表明接受高剂量载体(>1×108pu)治疗的患者中，CNV病变更易保持稳定或面积有所减小，可能发生剂量递增反应，从而为Ⅱ期临床试验疗效性的评价提供了基础。

然而，Ad载体的安全性令人担忧，严重死亡事件的发生限制了以Ad为载体临床试验的进行[20]，这也是AdPEDF.11临床试验没有继续下去的可能原因之一。后来学者们以AAV为载体表达PEDF，在小鼠模型中尚未发现病毒毒性，且显著抑制CNV的渗漏[21-22]，提示了基因疗法未来临床试验的方向。

3.2 RNAi

小干扰RNA(small interferon RNA，siRNA)是调节基因表达的双链RNA，通过RNAi导致基因选择性沉默[23]。Bevasiranib是首个用于治疗nAMD的小分子RNAi药物，是一种VEGF的细胞内转录抑制剂[24]。分别在2004年和2007年进行的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验(NCT00722384/NCT00259753)的早期结果显示出Bevasiranib治疗nAMD的潜力[25]，然而，至今尚无资料详细介绍其结果。由于不太可能达到主要终点，因而终止了Ⅲ期临床试验(NCT00499590)。

siRNA-027也称为AGN 211745，可靶向人、食蟹猴、小鼠和大鼠VEGFR-1 mRNA分子的保守区域，诱导VEGFR-1基因沉默。2007年，Kaiser等[26]招募了26例中位年龄82岁的nAMD患者，接受单剂量的siRNA-027(100、200、400、800、1 200或1 600 μg/眼)，结果显示未发现剂量限制性毒性，不良事件的严重程度为轻度到中度，视力和中央凹厚度稳定或改善。siRNA-027的Ⅰ期临床试验(NCT00363714)已表明其安全性，但由于无法达到所需的视敏度目标，以及siRNA直接激活Toll样受体3相关的脱靶效应，进而可能对血管和免疫系统产生不良影响，因而终止了Ⅱ期临床试验(NCT00395057)[27]。

PF-04523655是一种通过RNAi抑制缺氧诱导基因RTP801表达的siRNA，2007年的Ⅰ期临床试验(NCT00725686)已在27例nAMD患者中表明单次玻璃体腔内注射PF-0523655≤3 000 μg安全且耐受性良好[28]。Ⅱ期临床试验(NCT00713518)招募了151例nAMD患者，结果显示PF-04523655与雷珠单抗联合治疗的效果优于单药治疗[29]。

siRNA靶向性差，容易发生脱靶效应；稳定性不高，容易被酶降解，难以实现其目标活动；且在某些情况下可能触发不可预测的免疫反应，导致临床试验效果不佳，这些特点限制了其在临床治疗中的应用[23]。

3.3 sFlt-1

sFlt-1是VEGF的内源性抑制剂，过量的sFlt-1可以与VEGF高亲和力结合，从而中和VEGF[30]。sFlt01是一种新型融合蛋白，它由人VEGFR-1/Flt-1的VEGF结合域组成，该结合域通过聚甘氨酸接头与人IgG1的Fc部分融合，可与人VEGF结合[31]。

2010年，The Lions Eye Institute和Adverum Biotechnologies合作，在美国4家诊所进行了Ⅰ期临床试验(NCT01024998)，研究AAV2-sFlt01玻璃体腔内注射的安全性和有效性，在注射AAV2-sFlt01后的多个时间点，测定19例患者房水中sFlt01的表达水平，结果显示在注射2×108、2×109或6×109载体基因(vector genomes，vg)后的任何时间点，房水中均未检测到sFlt01，但在接受2×1010vg注射的10例患者中，有5例患者检测出sFlt01的峰值，提示可能存在剂量效应，仅1例出现眼内炎症，局部类固醇治疗后缓解，并且在停止治疗后未复发。这5例患者中，有4例患者抗AAV2血清抗体(AAV2的中和抗体)呈阴性，另1例患者的滴度非常低，为1∶ 100；另外5例给予2×1010vg而无sFlt01表达的患者中，4例患者抗AAV2血清抗体滴度非常高，1例无中和抗体，认为抗AAV2滴度高的患者可能不是AAV2基因治疗的良好候选者，但抗体滴度和载体剂量并非影响转基因表达的唯一因素，需要进一步研究结论的正确性以及AAV2-sFlt01的安全性及疗效[32]。

随后在2011年，nAMD患者视网膜下注射rAAV.sFlt-1的Ⅰ期、Ⅱa期临床试验(NCT01494805)在澳大利亚顺利进行。Ⅰ期临床试验中，招募的9例患者均在第0天及第4周接受玻璃体腔内注射雷珠单抗的治疗。在第7天，8例患者被随机分配，3例接受1×1010vg治疗(低剂量组)，3例接受1×1011vg治疗(高剂量组)，2例不接受基因治疗(对照组)，从第8周开始，每4周进行1次随访，直至第52周，共12次随访。随访中观察患者的最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)、光相干断层扫描和荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)结果，必要时对患者进行雷珠单抗抢救治疗。治疗组中6例患者有4例不需要抢救治疗，占67%，2例患者需要1次抢救治疗，占33%。在52周内进行多次评估，均未出现明显眼内炎、眼压升高及视网膜脱离等不良反应。第52周的随访结果显示，每例患者的BCVA和视网膜厚度均得到改善或保持稳定。在此基础上，研究者对其中6例患者进行了为期36个月的安全性评估，结果显示rAAV.sFlt-1视网膜下注射的耐受性和安全性良好，未见眼部及全身严重不良反应发生，绝大多数受试者的BCVA在18个月时保持稳定[33-34]。

Ⅰ期临床试验已证明视网膜下注射rAAV.sFlt-1的安全性和耐受性，由于样本量小，不能进行统计学分析，促使了2012年Ⅱa期临床试验的进行，招募的32例患者在第0天和第4周接受雷珠单抗玻璃体腔内注射，基因治疗组21例患者在第7天接受rAAV.sFlt-1(1×1011vg)视网膜下注射，对照组11例不做处理，结果表明未见与基因治疗相关的严重不良反应，基因治疗组和对照组从第0天到第52周，BCVA的中位数变化分别为1.0(-3.0，9.0)ETDRS字母和-5.0(-17.5，1.0)ETDRS字母。然而对照组的结果很可能是由于其中3例患者的并发症导致视力下降(>20个ETDRS字母)，当去除这3个受试者的数据后，基因治疗组和对照组之间的BCVA变化量比较差异无统计学意义[35]。视网膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的，但是仍需扩大样本量进行进一步的临床试验以证明视网膜下注射rAAV.sFlt-1的可行性。

3.4 内皮抑素和血管抑素

内皮抑素可抑制血管内皮细胞的增生、迁移，也可与VEGFR-2结合，从而竞争性阻断VEGF[36]，血管抑素可抑制血管内皮细胞增生，二者均是内源性血管生成抑制剂[37]。

Campochiaro等[38]在美国3个临床中心进行了开放标签、剂量递增的Ⅰ期临床试验(NCT01301443)，该试验首次以慢病毒马传染性贫血病毒(lentiviral equine infectious anemia virus，EIAV)作为载体，表达了内皮抑素和血管抑素(RetinoStat®)，旨在测试其安全性及表达谱。招募的21例晚期nAMD患者中，3、3和15例患者分别接受视网膜下注射2.4×104、2.4×105和8.0×105转导单位(TU)的RetinoStat®，结果显示每种剂量均具有良好的耐受性，没有剂量限制的毒性，仅1例患者出现因视网膜下注射导致的黄斑裂孔；房水中内皮抑素和血管抑素的水平与载体剂量相关，眼内持续表达高水平的内皮抑素和血管抑素可能会减少FFA中CNV的渗漏，但不能消除晚期nAMD患者的视网膜下和/或视网膜内积液，未提供有力的证据表明RetinoStat®的治疗益处，但其证明了视网膜下注射EIAV-RetinoStat®安全且耐受性良好，并可提供持续的转基因表达，其疗效仍有待进一步临床试验验证。在此基础上，Campochiaro等[38]又进行新的临床试验(NCT01678872)，进行RetinoStat®治疗nAMD患者的后续研究，旨在检验其长期安全性，该试验仍在持续进行中。

3.5 抗人VEGF抗体片段

在临床前试验中，Liu等[39]用AAV8表达了抗人VEGF抗体片段(anti-VEGF Fab)，在VEGF转基因小鼠(rho/VEGF小鼠)模型中，视网膜下注射AAV8-anti-VEGF Fab≥1×107基因拷贝(GC)的眼平均CNV面积明显小于对照组，数据有力地支持了anti-VEGF Fab在nAMD患者中的疗效。

RGX-314是重组AAV基因治疗载体，带有与雷珠单抗相关的抗VEGF抗体片段的编码序列。2017年3月，Regenxbio开展了Ⅰ/Ⅱa期、开放标签的、剂量递增临床试验，将RGX-314向视网膜下和脉络膜上递送，分别评估其安全性和耐受性(NCT03066258)。在视网膜下递送的试验中，招募了42例重度nAMD患者，分为5个组，6、6、6、12、12例患者分别接受3×109、1×1010、6×1010、1.6×1011和2.5×1011gc RGX-314治疗，截止到2020年7月13日，Ⅰ/Ⅱa期试验的患者对所有剂量的RGX-314耐受性良好，有18例严重不良事件，其中17例与RGX-314不相关。接受1.6×1011gc和2.5×1011gc RGX-314治疗的患者观察到持久的治疗效果，1年的随访期内，在眼中观察到剂量依赖性RGX-314蛋白表达，并稳定改善了视力和视网膜厚度[40]。在此基础上，Regenxbio公司计划启动一项AAVIATE试验，预计该试验将招募约40例重度nAMD患者，以评估2种剂量水平，即2.5×1011gc和5×1011gc RGX-314在脉络膜上递送的疗效、安全性和耐受性；主要评价指标为第40周时通过BCVA衡量患者平均视力的变化，其他评价指标包括视网膜中央厚度(central retinal thickness，CRT)的平均变化及抗VEGF注射的次数[41]。

3.6 sCD59

CD59可阻止C9募集到C5b-8复合物中，从而抑制膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)在细胞上的形成[42]，其含有糖基磷脂酰肌醇细胞膜锚定点，如果将其删除则会变成sCD59的形式[43]。Cashman等[44]研究表明，表达人类CD59可溶性非膜结合形式的Ad载体(AdCAGsCD59)在视网膜下递送可以减少小鼠MAC的形成及CNV病变面积，首次在动物体内证明了sCD59的生物效应。

2017年和2018年，Hemera Biosciences分别启动了关于AAVCAGsCD59的Ⅰ期临床试验。其中一项临床试验(NCT03144999)招募了干性AMD患者，分别玻璃体腔内注射低、中和高剂量AAV2-sCD59(HMR59)，以评估最大耐受剂量，并在18个月时进行安全性评估[45]。另一项临床试验(NCT03585556)中，湿性AMD患者接受玻璃体腔内抗VEGF治疗，并在注射后第7天玻璃体腔内注射HMR59。该研究计划将对患者随访12个月，必要时接受抗VEGF抢救治疗。主要评估指标为抗VEGF抢救注射的次数，次要评估指标为BCVA改善≥15个字母的患者例数及患有炎症、眼压>30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、视网膜脱离、白内障和全身不良反应的患者例数[46]。该研究将于2022年完成。

3.7 阿柏西普

ADVM-022是一种编码阿柏西普的AAV载体，在非人灵长类动物的CNV模型中，关于ADVM-022治疗的临床前评估结果显示，玻璃体腔内注射ADVM-022耐受性良好，并可导致持续的阿柏西普表达，可能为nAMD患者提供安全、有效的长期治疗[47]。

2018年11月，Adverum Biotechnologies启动了一项ADVM-022治疗nAMD患者的Ⅰ期临床试验(NCT03748784)[48]。至2020年11月14日，高剂量组和低剂量组各15例患者分别接受6×1011vg和2×1011vg ADVM-022治疗，结果显示受试者平均BCVA及CRT水平均得以保持或改善；ADVM-022治疗后，抗VEGF注射的频率大幅降低，高剂量组和低剂量组分别减少99%和85%；在高剂量组中，6例受试者单次玻璃体腔内注射实现了长达92周的零抗VEGF挽救性注射治疗；ADVM-022在高、低剂量下均具有良好的耐受性和安全性，所有与ADVM-022相关的眼部不良事件均为轻度或中度，分别占78%和22%，眼部炎症对类固醇滴眼液有较好的反应[49]。此外，Adverum Biotechnologies公司目前也积极开展了ADVM-022长期安全性的临床试验(NCT04645212)，目前正在试验中[50]。

3.8 GT005

2018年和2020年，Gyroscope Therapeutics公司分别启动了Ⅰ期(NCT03846193)和Ⅱ期(NCT04437368、NCT04566445)临床试验，其招募了补体因子Ⅰ(complement factor Ⅰ，CFI)基因突变的患者，以AAV为载体视网膜下递送GT005，通过增加CFI蛋白的产生来恢复补体系统的平衡，以减轻干性AMD患者的地图状萎缩(geographic atrophy，GA)，该试验已获得美国FDA授予快速通道资格[51-53]。

4 基因疗法治疗nAMD可能出现的问题

4.1 疗效问题

疗效问题是基因治疗十分重要且具有挑战性的问题，其与基因治疗的效果密切相关[54]。提高疗效的关键在于研制出转导效率及组织亲和力更高的递送系统。值得注意的是，体内针对病毒载体的中和抗体是影响疗效的关键因素，若其滴度较高，则不能实现目的基因的有效表达[55]。

4.2 安全问题

病毒的免疫原性及基因整合相关的安全问题应当引起重视。Ad的免疫原性较高[56-57]，该特点限制了Ad作为基因疗法载体的应用。此外，基因整合到宿主细胞基因组后，可能引起未知的基因突变，若发生原癌/抑癌基因突变，则有引起肿瘤的风险[54,58]。解决上述问题可能的方法之一是使用非整合型载体。

4.3 长期抑制VEGF的并发症

随着基因治疗技术的发展，长期抑制VEGF成为可能。但是，这种正常生理方式的抑制可能会对血管的发育、RPE及神经视网膜等多个方面产生不利影响。研究表明，RPE细胞产生的VEGF缺乏可引起脉络膜毛细血管密度减少[59]，长期抑制VEGF可能不利于nAMD的预后。一项体外实验中，Ford等[60]将永生化的人RPE细胞系ARPE-19作为研究对象，分别用贝伐单抗(中和VEGF)和IgG(对照)处理，结果显示贝伐单抗处理后RPE细胞凋亡增加。临床试验数据也表明，长期抗VEGF治疗可导致RPE的萎缩，进而引发GA[61]。此外，越来越多的研究表明，VEGF对神经元和神经胶质细胞有营养和保护作用[62]。在动物模型中已证明VEGF对视网膜神经节细胞的保护作用，VEGF水平的降低会导致视网膜神经节细胞的存活率降低[63]。

基因疗法治疗nAMD具有巨大的应用前景，动物实验及临床试验数据表明，基因治疗载体安全性和耐受性较好，其对CNV的治疗及视力改善有一定效果，但其剂量梯度的设计及疗效性的检验仍需进一步扩大样本量，以便于统计学分析，得出可靠性结论。同时，基因疗法抑制VEGF的长期安全性仍需进一步研究，为探索更安全、有效的nAMD治疗方法奠定基础。在前期研究的基础上，未来基因治疗的方向为多基因、多靶点、多方位联合治疗，从而达到更好的治疗效果。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突