黄韧带肥厚动物模型研究进展△

吴立康，陈 煜，宋国强，许 鹏

（1.常州大学药学院医学院，江苏常州2131642；2.山东中医药大学，山东济南250355；3.海军军医大学长征医院脊柱二科，上海200003）

黄韧带连接各椎体，起保护脊髓神经的作用。当黄韧带肥厚（ligamentum flavum hypertrophy，LFH)后，压迫硬膜囊和神经根导致患者出现下肢麻木或间歇性跛行的症状。建立可靠的动物模型对黄韧带肥厚的发病机制研究具有促进作用，也可体内验证新开发的治疗方法。黄韧带肥厚属于慢性退变性疾病，造模耗时长且个体间差异大给实验研究增加难度［1］。近年来，国内外关于黄韧带肥厚动物模型的制作方法多样，本文总结这些制作方法的进展，为进一步研究提供思路。

1 黄韧带肥厚的变化

影像学分析中，正常的黄韧带组织厚度应在4 mm以下，超过5 mm可判断为黄韧带肥厚。正常的黄韧带是一种结缔组织，主要由弹性纤维（80%）和胶原纤维（20%）组成。随着黄韧带的退变，组织肥大，表现为弹性纤维丢失和胶原纤维增多并沉积，具有纤维化病变的特征［2］。引起黄韧带纤维化的原因复杂，小关节和椎间盘退变是最直接的因素。小关节退变导致椎间序列不稳定，黄韧带受到异常的机械应力刺激［3］。长期的机械应力刺激引发组织微损伤和慢性炎症的产生，炎症因子的释放促使组织过度修复进而产生纤维化。纤维化是黄韧带肥厚的重要病理因素［4］，如果不能有效控制纤维增生，则会导致结缔组织在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积，成纤维细胞大量增殖，最终引起弹性纤维减少，胶原沉积增加。

在黄韧带肥厚的过程中，多种分子表达异常。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的表达增加，并刺激Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达增加［5］。肥厚的黄韧带组织中毛细血管明显增多，血管生成素样蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达增加［6］。这些因素共同作用，促进了成纤维细胞活化，最终引起黄韧带肥厚［7］。

2 动物模型建立的方法

近年来多个动物模型模拟了黄韧带肥厚的病理变化，考虑到经济成本及实验难度，实验动物以实验兔和实验鼠为主，模型重复性好，且生理与解剖特征与人相似。

相较于四足站立或俯卧态，双足站立姿势会使脊柱承受的压力增加，引起脊椎退变。有限元分析显示，直立姿态下，腰椎黄韧带韧带受到的应力明显高于伸展状态。Zheng等［8］利用小鼠的恐水诱导它们采取两足站立姿势，将小鼠置于类似烧杯的空间，底部有水，每天站立6 h。并对站立姿态的小鼠进行mi⁃cro-CT扫描，检查脊柱的变化。造模10周后，对黄韧带面积、弹力纤维/胶原纤维比值和细胞因子受体样因子1（cytokine receptor like factor 1,CRLF1）的表达进行定量。双足站立使腰椎黄韧带受力增加，引起黄韧带肥厚。组织学分析，实验组小鼠的黄韧带中，弹性纤维减少，胶原纤维和纤维化因子表达增加。该团队还发现，CRLF1表达增加与黄韧带肥厚具有重要关系，在CRLF1敲除的小鼠中，双足站立实验组却不会刺激肥厚。黄韧带肥厚是慢性疾病，久坐和不良坐姿会很大程度提高黄韧带肥厚的发病率。通过模拟人类站立的姿势，可造成黄韧带受到的挤压或牵拉应力增加。该方法使用的工具简单，但双足站立姿势引起的应力不够明显，造模效果有待验证，且样本间个体差异较大。

为了使黄韧带受到的机械应力增加，Sato等［9］人为的造成脊柱序列不稳，导致黄韧带受到异常的应力刺激，从而建立黄韧带肥厚模型。具体做法为：大鼠腰部后路切开，摘除L5棘突、L4～6棘上韧带、L4～5、L5～6棘间韧带。使得大鼠腰椎第5节段与上下段之间的正常平衡被打破，在术后的活动中，由于腰椎后方韧带被摘除，黄韧带受到的牵拉力大大增加。8周后处死取材。行EVG（Verhoeff's van Gieson）和Mas⁃son染色，模型组切片纤维排列规则变差，EVG染色显示整体区域弹性纤维变少，Masson染色显示胶原纤维增加，模型组黄韧带发生纤维化。他们还发现，纤维化在靠近横突的背侧区域更明显。这说明黄韧带的背侧受到的刺激更明显，在背侧的韧带更容易发生肥厚。

Hayashi［10］用实验兔进行黄韧带肥厚造模，进行L2～3和L4～5后外侧植骨融合术，并切除L3～4椎上肌。将机械应力集中在L3～4水平，用来增加L3～4黄韧带受到的应力刺激。而进行融合的L2～3和L4～5段的黄韧带则减少受到的应力刺激。术后16周，在机械应力的刺激下，黄韧带组织中弹力纤维断裂，软骨基质增多，与腰椎管狭窄患者的肥大黄韧带表现相似。该团队还用DNA芯片进行筛选，实验组成纤维细胞生长因子9的表达增加，主要集中在黄韧带末端或小关节周围，这是黄韧带退变肥厚的重要原因［11］。在李学朋［12］的研究中，双醋瑞因能抑制肥厚黄韧带中炎症因子的表达，改善纤维化。

通常在黄韧带肥厚的同时也伴随一定程度的椎间盘退变。通过后入路切除或破坏脊椎后方肌肉导致黄韧带受到的机械应力增加容易导致黄韧带肥厚，而退变的椎间盘导致椎体间序列变差，引起椎间序列不稳也会引起黄韧带肥厚。卜宪敏等［13］以新西兰大白兔作为实验动物，通过颈椎前路穿刺破坏纤维环及抽吸C4/5髓核组织建立兔颈椎不稳动物模型。4周后，C4/5节段黄韧带纤维排列变差，TGF-β1表达增加。

采用切除椎体之间韧带的方法可使黄韧带受到的应力刺激增加，但样本间差异依旧较大。在动物未处于行走活动的时候，黄韧带则不受异常的应力刺激。为了使样本受到的应力刺激量化，减少样本间差异，Saito［14］制作了一个可固定小鼠的装置，装置可电动控制，往复弯曲并强迫小鼠进行牵拉弯腰动作，每日持续3 h。12周后，通过组织学分析，应力牵拉装置使小鼠黄韧带增厚，胶原纤维面积，黄韧带成纤维细胞数量和纤维化相关因子增加。但这种机械应激模型并没有观察到巨噬细胞浸润、血管增加和TGF-β表达增加，而这些变化是人黄韧带肥厚的标志性变化，该装置并没有完全模拟黄韧带肥厚。

巨噬细胞浸润是黄韧带肥厚的重要特征，慢性炎症引起黄韧带组织中的巨噬细胞增加，分泌大量炎症因子和TGF-β1，刺激黄韧带成纤维细胞增殖分化，最终引起黄韧带肥厚。Saito团队［15］通过手术常规暴露小鼠椎体后棘突，钝性分离椎旁肌，暴露黄韧带。用30号针对黄韧带背侧进行微损伤，常规缝合。微损伤导致组织内巨噬细胞增加，黄韧带表现为肥厚，巨噬细胞刺激胶原表达增加，而当注射含有氯磷酸盐的脂质体清除巨噬细胞可抑制黄韧带肥大。

溶血磷酸脂酸（lysobisphosphatidic acids,LPA）的高表达可能与黄韧带肥厚正相关。Zhou［16］将LPA吸附在明胶海绵中，选择8周雄性SD大鼠，从腰椎L1～2棘突上方作纵向皮肤切口，分离椎旁肌。部分切除相邻的棘上韧带和棘间韧带。用明胶海绵作为载体，负载LPA，插入后外侧硬膜外和黄韧带之间。LPA通过激活LPAR1-Akt信号通路显著诱导黄韧带成纤维细胞增殖和抑制凋亡，最终引起黄韧带肥厚。

黄韧带的动物模型目前还不算成熟，多种椎间盘退变动物模型的造模思路也可能成为建立黄韧带肥厚的方法。将小关节突切除引起脊柱不稳，从而导致应力刺激增加，引起脊柱退变、小关节炎症［17］。此方法实验的动物黄韧带组织在应力和炎症反应下引发退变，但作者并未进行详细评价，且小关节切除时需把握好量，实际操作时容易直接损伤黄韧带。TGF-β1是引起黄韧带肥厚的重要因子［18］，可采用重组TGF-β1蛋白刺激黄韧带肥厚。这种方法可用于评估治疗黄韧带肥厚的治疗方案，尤其是有关TGF-β1参与的信号通路。

3 动物模型的评价方法

影像学检测：采用MRI可最直观的观察黄韧带的肥厚情况。也可应用CT、X线片等对椎体等骨骼退变的观察。

动物行为学观察：黄韧带肥厚造成腰椎管狭窄影响下肢行动能力，在建立黄韧带肥厚的动物可进行行为学观察，如斜板停留实验，BBB运动功能评分。

分子检测：对造模后的动物取材，收集黄韧带样本。通过PCR或WB分析多种黄韧带肥厚标志物的表达，如TGF-β1，ColⅠ和Ⅲ等。但这种方法不适用于大鼠或小鼠，由于鼠的脊柱结构较小，其黄韧带的体积也很小，检测结果不够稳定。

组织切片染色：在取材时，很难完整的直接分离出黄韧带，一般将整个脊柱节段保留。进行组织切片检查。为了保证结果的准确性，应取相同节段，尽可能选择相似的位置进行切片。除了HE染色，还可以选择EVG染色天狼猩红（sirius red）染色和Masson染色。其中EVG染色是将弹性纤维染成蓝黑色，将胶原纤维染成红色，天狼猩红染色将胶原纤维染成红色，Masson是将胶原纤维染成蓝色。用软件对样本间染色面积进行统计，比较弹性纤维/胶原纤维的比值。此外，切片后还可对ColⅠ、TGF-β1等黄韧带标志物免疫组化分析。

建立黄韧带肥厚动物模型的目的在于模拟人类黄韧带退变肥厚的组织、细胞及分子变化，用于研究黄韧带肥厚的发生机制。也可以对体外研究的内容在动物体内进行验证，评价其在组织整体微环境下的适用情况。在上述的黄韧带肥厚动物模型中，利用黄韧带受到异常应力刺激，损伤或其他刺激以引起炎症反应，从而引起动物的黄韧带肥厚。但也存在一定的问题：（1）实验结果不稳定；（2）难以全面的模拟人黄韧带退变肥厚的机制；（3）造模时间长，难度大。黄韧带肥厚的动物模型建立还处于初步探索阶段，黄韧带肥厚的体内研究亟需一个稳定且高效的动物模型。