淋巴上皮瘤样癌分子病理研究进展

尹文娟， 苏 丹， 谭蔚泓

淋巴上皮瘤样癌(lymphoepithelioma-like carcinoma,LELC)是一种少见的上皮性恶性肿瘤，其最主要的特点是肿瘤背景中存在大量的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)[1]。LELC可发生于消化、呼吸、皮肤、泌尿、生殖等系统的各个器官[1-7]，但以肺部、唾液腺及胃部发生者最为多见。临床上对于LELC尚无标准的治疗指南，目前多采用与该系统其他肿瘤同样的治疗方案[2，8-10]。有研究显示肺部、胃部及肝脏等部位LELC预后较同部位的其他类型肿瘤预后好[2，11-13]。但研究样本量较小，其结论尚需多中心大样本研究数据进一步证实。LELC虽然少见，但具有高度的异质性，不同患者在病因、发病机制和临床病理特点及分子病理改变方面均存在差异。深入了解LELC病因、发病机制、临床病理特点及分子病理改变的特点，有助于LELC精准治疗决策实施，本文就其研究进展进行综述。

1 病因及流行病学

文献报道LELC患者发病年龄范围广，为9～89岁，在上消化道、头颈部及呼吸系统，LELC发生的中位年龄约为50岁[5，14-16]，而泌尿系统LELC发生的中位年龄较高，为68～71岁[17-18]。整体上男性LELC发病率高于女性。LELC可累及全身各个器官，以头颈部多见。LELC的发生与病毒感染密切相关，最常见的是EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染，头颈、唾液腺、肺部、胃部的LELC与EBV感染关系尤为密切[1，6，15-16，19]。而发生于肝脏的LELC大部分与肝炎病毒感染关系密切，少部分与EBV感染密切相关[2]。泌尿生殖系统如膀胱、肾脏、前列腺、宫颈及子宫内膜等部位的LELC与EBV感染并无明显相关性[7，20-22]。有研究发现宫颈的LELC和人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)有较强的相关性[21-22]。目前报道的大部分肺部原发的LELC似乎更常见于亚洲人尤其是华裔[5，13-14，23]，大宗病例Meta分析发现EBV阳性胃癌LELC在南美洲及中国南方人群中发生率较高[24]。而肝脏中LELC肝炎病毒相关者主要在欧美的白种人中多见，而EBV相关的肝脏LELC主要发生于亚洲人群[2]。泌尿生殖道的LELC由于报道的病例数较少，目前尚未发现其与微生物感染之间的关系，其人群分布特征也未明了[3]。

2 发病机制

2.1EBV EBV感染是大部分LELC发生的始动因素。EBV是国际癌症研究机构最早确定的致癌的微生物因素，全世界每年因为感染EBV而新增恶性肿瘤患者约有20万人[25]。EBV又称4型人类疱疹病毒(human herpes virus 4,HHV4)，是172 kbp的双链DNA病毒，人类对EBV普遍易感，超过90%的正常人感染过EBV，多为无症状携带。EBV主要通过唾液传播，EBV首先通过其鞘膜蛋白gp350与灵长类宿主的B细胞表面受体CD21结合，感染鼻咽、口咽部的B细胞，继而感染周围上皮细胞[26]，90%的正常人经过急性期感染会建立对EBV的获得性免疫。急性感染期过后，EBV会潜伏在B细胞及上皮细胞内，将其基因组整合到宿主细胞基因组后，可以编码相应的延迟基因表达产物[27]。EBV的编码产物为2种潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP)、6种EBV核抗原(Epstein-Barr nuclear antigen,EBNA)、2种EBV编码的小RNA(Epstein-Barr virus encoded small RNAs,EBERs)及40多种非编码小RNA[28]。目前已经证实与肿瘤发生最为密切的有潜伏膜表达蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)。研究发现其他病毒产物如潜伏膜表达蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)[29]及EB病毒核抗原1(EBV-nuclear antigen 1,EBNA1)、EB病毒核抗原2(EBV-nuclear antigen 2,EBNA2)也参与了肿瘤的发生[30]。根据宿主细胞表达EBV产物的谱系，EBV潜伏感染可分为3种类型： Ⅰ 型，宿主细胞仅表达EBNA1和EBER；Ⅱ型，宿主细胞可表达EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A/B和EBER；Ⅲ型，宿主细胞表达所有EBV相关蛋白及EBER。被感染的B细胞可在3种潜伏类型之间转换，而上皮细胞仅存在Ⅱ型潜伏感染[31]。

2.2EBV感染相关的致瘤机制 LMP1是最早被确定的具有独立致癌活性的原癌蛋白，LMP1为7次跨膜蛋白，活性结构域包括位于胞内的2个转录效应位点(transformation effector site,TES)结构域和C-端的活化区(C-terminal activation region,CTAR)，TES2通过募集含有肿瘤坏死因子受体相关的死亡结构域蛋白，活化肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TARF6)，活化的TARF6进一步催化63位赖氨酸偶联肽链的聚泛素化组装，进而招募并激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中重要的分子TAK1，从而通过经典途径激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路[32]。在EBV感染的B细胞中，LPM1还可以通过TES1活化肿瘤坏死因子受体相关因子3/5(TARF3/5)，继而通过非经典通路激活NF-κB通路[33]。而LMP1的CTAR1区域亦可活化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)促进PI3K/蛋白激酶B(alpha protein kinase B,AKT)及下游信号通路激活[34]。这些信号通路激活会导致下游细胞增殖、分化、代谢、迁移等相关生物学效应改变。LMP1还可以通过调节肿瘤代谢促进肿瘤增殖。研究表明LMP1介导的细胞NF-κB通路激活可以使葡萄糖转运酶1表达增高，并促进其从胞浆定位到细胞内膜结构，促进肿瘤细胞的糖酵解增加，提高肿瘤细胞对乏氧环境的耐受[35]。EBV相关的上皮性肿瘤的代谢组学分析发现，LMP1可以促进其他糖酵解通路相关酶表达增加，其中糖酵解限速酶己糖激酶2表达增加与肿瘤的放疗抵抗及不良预后密切相关[36]。LMP1还可以激活类固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP1)，从而上调其下游脂肪合成酶(fatty acid synthase,FASN)基因的表达，促进脂肪生成和利用，减少对有氧糖代谢的依赖。此外SREBP1的激活还参与了LMP1对mTOR通路的激活[37]。另一方面，LMP1可以通过激活NF-κB通路促进程序性死亡受体-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)蛋白表达升高，参与免疫逃逸。LMP1还可以通过表观遗传调控促进肿瘤的发生和增殖。DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferases,DNMT1)和10-11转位甲基胞嘧啶双加氧酶(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenases,TETs)是调节DNA甲基化和去甲基化的两个关键的作用相反的酶。LMP1促进糖酵解途径激活导致氧化磷酸化过程中间代谢产物α酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)减少，同时促进异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)表达增加，IDH2催化α-KG生成α羟戊二酸，使α-KG进一步减少，进而使依赖α-KG的TETs无法激活。同时LMP1可以通过NF-κB通路促进DNMT1表达上调，最终DNA甲基化失衡，导致大量抑癌基因启动子区域呈超甲基化状态，使其基因表达沉默失去抑癌活性。在LELC中常见的有CDKN2A、CDH1、MGMT等基因启动子的超甲基化[38]。LMP2A同样是跨膜蛋白，其结构与B细胞受体(B cell receptor,BCR)相似，但其N端有9个酪氨酸残基并含有免疫受体酪氨酸激活结构域，因此LMP2A可以阻断正常BCR受体信号并异常激活BCR下游酪氨酸激酶(tyrosine kinases,PTKs)级联反应通路。此外，LMP2常和LMP1一起共定位于肿瘤细胞膜，与LMP1一起协同激活PI3K/AKT、NF-κB等信号通路，共同促进肿瘤增殖[39]。体外实验证实，单独携带LMP1基因的模型小鼠仅有少数形成低分化鳞状细胞癌，而单独携带LMP2基因的小鼠仅能形成乳头状肿瘤，无法形成恶性肿瘤，而同时携带LMP1及LMP2基因的模型小鼠形成低分化鳞状细胞癌的比例显著增加[40]。研究表明EBV编码的核蛋白可以通过表观遗传调控机制参与肿瘤的发生，EBNA1可以通过影响基因组增强子及启动子甲基化及组蛋白乙酰化，使得组蛋白3的27位赖氨酸点乙酰化(H3K27ac)增加，其结果是激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)基因上调表达，ATF3进一步与下游基因增强子区域结合，促进细胞生长信号通路的活化[41]。Zheng等[42]使用甲基化RNA免疫共沉淀测序的方法发现EBNA2可以与mRNA 3′端N6-甲基腺苷(m6A)结合，通过影响肿瘤基因组转录后修饰，调节肿瘤细胞蛋白表达。尽管乙型肝炎病毒在肝细胞肝癌发生过程中的作用机制已经被深入报道，但其在肝脏LELC形成过程中的具体机制上仍缺乏研究。宫颈LELC是宫颈低分化鳞状细胞癌的特殊形态学亚型，其发生机制与HPV蛋白产物E5、E6关系密切。

3 临床病理特征

3.1大体表现 大体上，LELC常为单发，表现为边界清楚的结节，与周围正常组织有相对清晰的边界。胃部LELC常表现为黏膜隆起或浅表溃疡，膀胱LELC表现为黏膜菜花状肿物。

3.2形态学表现 形态上，经典的LELC似低-未分化型鼻咽部非角化性癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)，病理检查可见小巢状或片状增生的上皮性肿瘤细胞，细胞大，多边形，胞浆丰富，双嗜性。瘤细胞边界不清，常呈合体状。核大，圆形或类圆形，核染色质细，淡染，部分肿瘤细胞分化差，可为梭形细胞样。头颈部LELC肿瘤成分以低分化鳞癌为主，间质TILs丰富，部分肿瘤以浸润淋巴细胞为主，而肿瘤性上皮成分少，在小的活检组织中易造成漏诊。而胃部LELC肿瘤分化差，小巢状或片状分布，可出现分化不良的小管结构[43]。肝脏LELC肿瘤有两种类型分化，一种向肝细胞性肝癌分化[淋巴上皮瘤样肝细胞癌(lymphoepithelioma-like hepatocellular carcinoma,LEL-HCC)]，肿瘤分化差，排列呈条索状，局部可见肝板样结构分化，肿瘤间质及周围伴显著的淋巴细胞浸润，周围肝脏常有慢性肝炎的背景，此类型肿瘤中肝炎病毒(B型和C型)阳性率超过70%，而EBV阳性率较低。另一种类型肿瘤细胞呈胆管细胞癌分化[淋巴上皮瘤样肝内胆管细胞癌(lymphoepithelioma-like cholangiocarcinoma,LEL-CC)]，肿瘤分化差，呈小巢状或低分化管状结构，间质内见大量的淋巴细胞浸润，典型的LELC区域可以和经典的胆管细胞腺癌混合存在，此类患者的EBV阳性率为74%，肝炎病毒感染率仅为30%[2]。泌尿系统LELC以膀胱原发为主，病理类型多为高级别的浸润性尿路上皮癌，约40%为单纯型LELC(>50%的区域为LELC)，而45%的病例为混合形态，混合型中以高级别尿路上皮癌混合腺鳞癌或鳞状细胞较为多见[17]。需要注意的是，LELC是一个形态学的诊断名称，其形态学特征是间质内可见较多的TILs[1，6，19，44-45]。由于其与EBV的高度相关性，过去认为LELC就是EBV相关性癌，而随着研究的深入，现在认为EBV相关性癌与LELC大部分病例重叠，但并不完全等同。研究发现，在肺部原发的EBV相关的癌中，肿瘤形态学特征存在谱系性变化，谱系一端病变表现为经典的LELC，间质内富含大量的TILs，而另一端接近普通类型的低分化鳞状细胞癌，间质缺乏TILs浸润[15]。如前所述，LELC也并不全是EBV相关性癌。我们前期研究发现136例原发鼻咽部外的病理诊断为“LELC”的患者中，120例为EBV阳性，分布在头颈部、胃、肝及肺部；另有16例为宫颈、膀胱、直肠等部位原发，为EBV阴性。进一步对120例EBV阳性的LELC进行分析，结果发现LELC形态学的谱系分布现象不仅在肺组织LELC中存在，在口腔、唾腺、胃部等其他部位，LELC的形态也存在类似的谱系分布，在此基础上我们提出了LELC可以在形态上分为Ⅰ型和Ⅱ型EBV相关性癌，Ⅰ型EBV相关性癌特征为间质富含TILs(经典的LELC)，Ⅱ型EBV相关性癌间质缺乏显著的TILs浸润(非经典型LELC)[16]。Ⅰ型EBV相关性癌预后显著优于Ⅱ型，提示TILs的多寡可作为区分LELC预后的形态学标志，然而TILs多寡的标准尚需进一步明确。

3.3免疫表型 免疫标志物方面，多数头颈部、呼吸系统LELC表达CK、EMA、CK5/6、P40、p63[1，13]，提示其本质是低分化鳞状细胞癌；胃部LELC表达CK7、低分子量角蛋白等[46]，肝脏LEL-HCC除了表达CK7、低分子量角蛋白，还可以表达Heppar-1、APF经典的肝细胞癌标志物[2]，而LEL-CC表达胆管细胞标志物；尿路上皮来源的LELC可表达P40、CK7及SATA3[18]。

4 分子病理特征

LELC中病毒与宿主细胞基因断裂重组导致癌基因与抑癌基因的活化失衡是肿瘤发生的关键因素。对多种EBV相关性肿瘤进行宏基因组测序分析发现，EBV基因组与人类基因组存在广泛的整合，EBV基因与人类基因组的整合热点主要位于抑癌基因和炎症相关基因分布区域。EBV基因组主要的断点主要位于oriP和末端重复序列，其基因插入到人类基因组内含子区域可造成TNFAIP3、PARK2和CDK15等多种炎症相关基因表达下降[47]。虽然不同部位LELC分子病理特点有所差异，但仍具有一些共同的改变，如基因组突变负荷较低、抑癌基因启动子甲基化失活、免疫检查点基因扩增等。2014年癌症基因组计划研究组根据胃癌的基因表达及表观遗传学改变将胃癌分为4种亚型，其中EBV相关型胃癌(病理类型大部分为LELC)最显著的分子学特征是PIK3CA突变，CDKN2A启动子超甲基化失活，JAK2、PD-L1和PD-L2基因扩增[11]。Hissong等[48]针对31例胃LELC研究，综合分析了EBV感染、错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白表达及基因表达情况，将其分为EBV+/MMR正常组、EBV-/MMR缺陷组和EBV-/MMR正常组三组，分析发现所有患者均无HER2蛋白阳性表达及HER2基因扩增，PD-L1蛋白在肿瘤细胞中阳性率为67.7%(>1%肿瘤细胞表达为阳性)，而在TILs中表达为74.2%。EBV-/MMR缺陷组肿瘤突变负荷及KRAS基因突变率均为最高(56%)，而EBV-/MMR正常组TP53基因突变率显著高于EBV+/MMR正常组。提示胃部LELC分子特点具有谱系变化特征，PD-L1的高表达率提示免疫检查点抑制剂是胃部LELC治疗的可选方案。转录组及表观遗传学研究发现：在EBV相关胃癌细胞系中，19 992个开放染色体增强子区域组蛋白3的第四个赖氨酸位点甲基化状态改变[H3K4me1(+)H3K4me3(-)增加]；而10 260个区域H3K27ac增加。染色体-蛋白免疫共沉淀测序及模序分析发现这些激活的增强子区域大多是ATF3蛋白结合的靶位点。ATF3基因敲除后引起LELC胃癌细胞株中相应靶基因表达下调及细胞增殖显著受抑，提示ATF3基因激活是EBV导致LELC发生的重要机制。而在口腔颌面部LELC中，甲基化特异的PCR检测分析也发现多个抑癌基因启动区域的高度甲基化失活，包括E-cadherin、p16(INK4a)、p14[49]和MGMT[38]。一项12例LEL-HCC和15例普通型肝细胞性肝癌(conventional hepatocellular carcinoma,C-HCC)全外显子测序研究发现，整体上LEL-HCC和C-HCC突变负荷相似，但11q13局部扩增在LEL-HCC较为普遍，此区分布着CCND1、FGF19和FGF4基因，这些基因常与免疫检查点基因CD274(PD-L1)、PDCD1、BTLA、CTLA4、HAVCR2、IDO1和LAG3表达密切相关。此外CTNNB1、AXIN1、NOTCH1及NOTCH2等基因发生的单核苷酸变异(single nuclear variation,SNV)在C-HCC中较LEL-HCC更为常见，提示LEL-HCC有其独特的分子遗传学特点，临床治疗应该考虑在常规治疗基础上增加免疫检查点抑制剂的治疗[50]。深度测序研究发现，肺部LELC中突变负荷较低但存在广泛的拷贝数变异，这些变化涉及的细胞信号通路有NF-κB、JAK/STAT以及细胞周期信号通路，此外聚类分析还发现在基因变异特点方面，肺部LELC与其他EBV相关性肿瘤如NPC、NK/T细胞淋巴瘤更为类似，而与肺部原发的其他类型癌有明显的区别[51]。使用显微切割排除了背景淋巴细胞遗传物质干扰的肺部LELC测序研究结果，与之前的发现略有不同，一项纳入57例EBV阳性的原发肺部LELC患者的测序研究发现，11%的肿瘤存在TP53的突变，而其他的驱动基因突变频率相对较低，RTK/RAS/RAF通路基因突变率为11%，而PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路基因突变率为7%，另各有4%的患者中检出纤维生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)异常，4%的患者检测到错配修复基因异常(mismatch repair deficiency,MRD)，与其他研究相似，该研究也发现PD-L1基因广泛扩增[52]。Xie等[53]在对29例肺部LELC患者520个基因大Panel目的基因测序研究中发现肺部LELC中存在显著(78%)的甲基化调控相关基因的突变，52%的患者存在基因拷贝数变化。该研究还发现69%的患者PD-L1表达阳性，其中4例患者接受了免疫检查点抑制剂治疗并从中获益。这些分子遗传学的研究成果为临床精准治疗提供了参考。Manocha等[54]对14例膀胱LELC患者样本的转录组数据进行了预测分析芯片分类方法分析，发现12例膀胱LELC主要的RNA表达呈现基底细胞样癌的特点。此外，基因分析还发现TILs富集特征与组织学上大量淋巴细胞浸润的现象一致。同时免疫组化研究发现93%的膀胱LELC表达PD-L1，而MMR蛋白缺失比例较低(仅6%)。根据PD-L1表达及基底细胞样型的基因表达特点，提示免疫检查点抑制剂可以作为治疗膀胱LELC的可选方案。在1项个案报道的基因测序中，研究发现原发子宫内膜LELC中存在TP53、PIK3CA突变[55]。

5 展望

LELC是一组高度异质性肿瘤，各部位LELC基因表达及分子病理学特点不尽相同，对LELC的发生机制、临床特点的准确理解及规范化治疗方案的制定尚需大样本研究数据的进一步积累和证实。但有一点不难发现，在各部位的LELC中均存在PD-L1基因扩增或PD-L1蛋白表达，提示免疫检查点抑制剂治疗是LELC可选的治疗方法。一项针对EBV蛋白EBNA1和LMP2而开发的肿瘤疫苗MVA-EL的Ⅰ期临床实验结果表明其免疫有效性达66.7%[56]，提示EBV疫苗有望成为预防LELC的有效手段。血清学EBV相关指标检测对于诊断EBV相关肿瘤及评估预后有一定价值[57]。