东北地区禽腺病毒4型的诊断与防控

吕忠蕾

吉林元和元生物工程股份有限公司，吉林长春 130000

禽腺病毒是一类中等大小无囊膜的线状单分子双股DNA病毒，一种全世界范围内流行的家禽和野禽常见的传染病病原。心包积水-肝炎综合征（HHS）是由I群禽腺病毒4型(FADV-4)引起的一种高传染性和高死亡率的禽疫病。该病一年四季均可发生，其特征性症状为3～5周龄鸡突然死亡，个别鸡在死亡前出现精神沉郁、羽毛蓬乱、翅膀下垂、食欲废绝、双脚麻痹、排黄绿色稀便等生理症状，临死前有的鸡发出尖锐鸣叫声，并出现角弓反张等精神症状。剖检后病变主要见于心脏、肝脏、肾脏和肺脏。剖检的鸡多数都有比较明显的心包积液，积液颜色呈淡黄色、澄清的液体，有的呈胶冻状，心脏外层呈水囊状，心脏多松弛畸形、心脏内膜有出血点；肝脏可见肿大、表面有出血点、触碰易碎、颜色呈淡黄色或土黄色；肺脏出现充血或水肿；肾脏呈现出花斑状，充血肿大。禽腺病毒既可水平传播也可垂直传播，广泛分布于世界各地的禽养殖业。禽腺病毒发病特征一般呈急性发作，死亡率颇高，给禽养殖业带来较大的经济损失。

2021年4～5月期间，东北地区辽宁、吉林、黑龙江三省多次送检禽病样品，解剖后可见病死鸡有明显的心包积液症状、肝脏和肾脏充血肿大等病变。根据其发病症状、解剖情况并结合实验室检测分析，最终诊断结果为禽腺病毒4型感染。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

由东北地区辽宁、吉林、黑龙江三省送检的病鸡，主要表现为食欲减退、精神萎靡、羽毛松乱、排黄绿色稀便。剖检可见淡黄色或胶冻状的心包积液,心肌松软充血；肝脏充血肿大，颜色变浅或呈土黄色，常见黄白色坏死灶或针尖状出血点；肾脏充血肿大，有时因尿酸盐的沉积呈花斑肾样变化。取以上三个地区病鸡的病变肝脏、肾脏和心包积液提取病毒核酸DNA。

1.1.2 试剂

病毒核酸提取试剂盒，胶回收纯化试剂盒购自北京爱思进生物科技有限公司，琼脂糖，2×Taq PCR Mix、DNA Marker DL2000均购自TAKARA公司。pEASY-T5 Zero Cloning Kit试剂盒购自TRANS。

1.2 引物设计

根据GenBank登录的FADV-4的Hexon基因核苷酸序列，设计用于扩增FADV-4的PCR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列片段大小为527 bp，上游引物：TGYTCGTTGTGGATSGTGAA，下游引物：CTTYGTKKTGGG NTGGTCG。

1.3 病毒核酸DNA的提取

取患病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心包积液等病料组织剪碎、研磨混合后，加入5倍体积的PBS缓冲液制成组织悬液（液体病料如心包积液无需研磨，直接取200 µL进行提取），震荡混合均匀，然后根据病毒核酸提取试剂盒说明书操作，简述如下：收集200 µL的样品，转入1.5 mL的离心管内（如果样品有细胞细菌污染，可先12000 rpm离心5 min，取上清200 µL作为样品）；加入200 µL的Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀后，在室温条件下静置5 min；加75 µL Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀，12000 rpm离心5 min；取上清液体加入到新的2 mL离心管（试剂盒内提供），加300 µL异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6～8次，混合均匀；将吸附柱置于无菌的2 mL离心管中，将上一步的混合液全部移入吸附柱中6000 rpm离心1 min；弃废液，将吸附柱回到2 mL离心管中，加500 µL的洗液1后，在室温条件下静置1 min后，12000 rpm离心1 min；弃废液，将吸附柱回到2 mL离心管中，加800 µL的洗液2后，12000 rpm离心1 min，弃废液；将吸附柱回到2 mL离心管中，12000 rpm空柱离心1 min；将吸附柱置于无菌的1.5 mL离心管，在吸附膜中间位置加50 µL的Buffer TE，室温静置1 min，12000 rpm离心1 min洗脱DNA，DNA模板可放置于-20 ℃保存。

1.4 PCR扩增

将已提取的病毒DNA模板进行PCR扩增，PCR反应体系共20 µL，2×Taq PCR Mix 10 µL，上下游引物各1 µL，DNA模板1 µL，ddH2O 7 µL。94 ℃预变性反应5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，同时设置阴性对照。同时进行禽流感病毒通用型、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的PCR/RTPCR检测，其检测方法参照其相对应的国标。

2 结果

2.1 PCR产物的鉴定

PCR反应结束后取5 µL的扩增产物，加入到已配制好的1%琼脂糖凝胶槽中，放入电泳槽后进行电泳实验，实验结束后于凝胶成像系统下观察电泳结果。结果显示，待检测的DNA模板扩增出527 bp左右大小的条带，而阴性对照未出现相对应的条带，而禽流感病毒通用型、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒均未扩增出条带。

2.2 测序分析

将PCR产物经过回收纯化后连接到 pEASY-T5 克隆载体中，将上一步的连接产物加入到Trans1-T1感受态细胞中，将最后获取的全部菌液涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养12～16 h左右，观察有无菌落生长，接下来挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基上，在200 rpm、37 ℃摇床培养6 h左右，取1 µL菌液于25 µL的PCR反应体系中用于鉴定阳性克隆。将克隆结果阳性者送到上海生工生物工程有限公司委托其测序，将最后获得的测序结果用DNAMAN软件与NCBI进行比对，结果为禽腺病毒4型分离株GDMZ，GenBank登录号为 MG856954.1。

3 讨论

通过对东北地区患病鸡的病原检测发现禽腺病毒4型的检出率要高于新城疫、禽流感和传染性支气管炎，可能是由于养殖场对禽腺病毒的诊断以及防治方面存在欠缺之处，因此导致近几年养殖场感染禽腺病毒的死亡率上升，该病毒可通过候鸟迁徙、活禽运输、粪便、垂直传代等方式传播。

4 防治措施

4.1 净化源头

以预防为主为原则，避免从疫情区、有过禽腺病毒病史的养殖场引进种禽或者购买雏禽。禁止未经消毒的车辆和用具随意进入养殖场，及时发现并淘汰鸡群内早期发病鸡只并进行相应无害化处理，加强并定期对鸡舍养殖环境消毒。

4.2 接种疫苗

选择市面上适宜的血清型疫苗进行接种，接种禽腺病毒疫苗要注意防止其它病原的交叉污染，否则可能导致本次免疫的失败。

4.3 环境消杀

对鸡舍进行消毒首选福尔马林或戊二醛等对腺病毒比较敏感的消毒剂。环境及用具消毒可以用5%烧碱液或石灰澄清液，带禽消毒首选安全性和高效性的0.3%过氧乙酸和氯制剂。

5 总结

东北地区禽腺病毒4型检出率较高，但无法确定其传染源，因此只能通过采取综合防治措施，饲养、管理、消毒和免疫四个环节缺一不可。同时要加强对禽流行病学的调查工作,准确把握当地流行血清型,及早预测疫情的发展,对做好防控至关重要。

参考文献：略