植物花药发育调控基因AMS的研究进展*

赵重燕，暴会会，杜康华，杨正安，杨 飞

(1.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学，云南生物多样性保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

雄性不育优良品系的创新一直是科学家们的研究重点[1]。拟南芥花药发育过程中约有3 500 个花药特异转录本[2]，反映了花药发育过程基因的多样性及复杂的花药发育调节过程，花药发育调控机制的研究在雄性不育过程中十分重要，因此对花药发育调控基因的研究具有重要的意义。

在植物花药发育过程中，绒毡层特异表达基因(aborted microspores，AMS)是绒毡层和小孢子发育所必需，是植物花粉壁合成的关键因子。AMS包含1 个基本的螺旋—环—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)域，属于bHLH 转录因子中的MYC 类亚家族基因[3]。MYC 蛋白已被认为是控制细胞周期的关键调节因子，它可以激活或抑制特定的靶基因表达[4]。AMS基因也具有相同的调控作用，该基因突变会导致过早的绒毡层退化和花粉败育。AMS基因在不同植物的小孢子发育调控网络中存在高度相似性，目前已在拟南芥、水稻、甜瓜、辣椒、葡萄、大豆和洋葱等植物上进行过研究。本文综述不同植物中AMS基因功能研究进展，分析花药发育的复杂调控途径。

1 花药和花粉发育

在开花植物中，花药发育是调节花药内特定细胞分化的复杂事件[5]，涉及多个雄蕊特异性转录本，是植物育种的关键步骤，也是成功育种和形成种子所必需的环节。花粉的形成取决于花药中2种细胞类型的分化和相互作用[6]：生殖细胞(小孢子细胞)和形成绒毡层的体细胞。小孢子被由内到外的绒毡层、中间层、内皮层和表皮层4 个体细胞层所包围，从而支持小孢子发育为成熟的花粉粒[7]。花粉发育是一个复杂的过程，涉及许多事件，尤其是绒毡层发育和花粉外壁形成。绒毡层作为分泌细胞层，不仅与发育中的配子体直接接触，且提供酶促进四分体释放小孢子，提供蛋白质、脂质和多糖等养分促进花粉壁的形成，从而促进花粉的发育[8]。在花粉发育的后期会经历绒毡层细胞程序性细胞死亡(program cell death，PCD)事件[9]，依次消除细胞结构。绒毡层细胞的分化和随后的分解与减数分裂后的花药发育程序非常吻合，绒毡层的过早或延迟降解与雄性不育有关[10]。花粉外壁主要由孢粉素形成，孢粉素是一种脂族聚合物，由长链脂肪酸、苯基丙烷和氧化的芳香环衍生的一系列聚合物组成[11]。

花药和花粉的发育已经在拟南芥、水稻、黄瓜和辣椒等植物中得到广泛的研究[12-13]，从双子叶模式植物拟南芥到单子叶模式植物水稻2 个物种的花粉发育都涉及相似的关键阶段。不同物种中直系同源基因的雄性不育突变体的特征进一步证明这些阶段背后调控途径的保守性。这对了解和研究其他植物中花药发育调控途径具有重大的意义。

2 AMS 基因与植物雄性不育

AMS属于bHLH 家族转录因子，是植物花粉壁合成的关键因子，AMS突变植株会导致花粉形成异常，进而造成雄性不育。植物雄性育性的控制对于作物育种、杂种的产生以及花粉释放的控制至关重要。目前，已在许多植物中发现雄性不育株，并经过人工选育获得不育系广泛应用于生产[14-15]。但是对于花粉不育类型和雄蕊退化型性状的保持比较困难，且不育特性受环境影响较大，不易获得100%不育度，致使花粉不育和雄蕊退化型极少在生产上应用[16]。因此加强对雄性不育调控机制的研究很有必要，以此可获得有应用价值的不育材料。对不同物种AMS突变体的形态学、遗传学和分子生物学等的研究，可为阐明复杂的花药发育调控途径奠定基础。

2.1 AMS 基因调节拟南芥雄性不育

AMS基因参与植物雄性不育调控的研究首先在拟南芥(Arabidopsis)中被报道[3]，研究者分离获得败育的小孢子(ams)突变体，对AMS突变植株进行表型鉴定及序列分析，发现纯合突变植物完全没有成熟的花粉，花粉败育发生在小孢子从四分体释放后不久、有丝分裂I 之前。AMS在拟南芥花药的绒毡层细胞发育和减数分裂后转录调控中起着至关重要的作用。XU 等[17]通过微阵列分析拟南芥AMS突变植株的花药，结果表明：ams突变体中，有549 个与绒毡层和花粉壁形成有关的花药基因的表达发生变化，还鉴定出涉及脂质、寡肽和离子运输、脂肪酸合成和代谢以及黄酮醇积累等有关的13 个基因是AMS的直接靶标。MA 等[18]同样对AMS突变植株早期的花药进行转录组分析，发现有1 368 个基因在ams中差异表达，影响代谢、运输、泛素化和胁迫反应。对转录组的仔细分析并将其与遗传和系统发育信息相结合，揭示了在花药早期发育过程中建立的精细调控网络，并扩大了对与花药发育相关的基因层次结构的理解。AMS基因在花粉壁形成过程中有重要的调控作用，XU 等[19]用全基因组共表达分析揭示了在拟南芥ams突变体中有70 个花药特异表达候选基因表达量降低，这其中有23 个基因是AMS 调控的靶基因。这些基因与脂肪酸延伸、酚类化合物的形成及孢粉素前体合成有关，证实丰富的花粉外壳蛋白细胞外脂肪酶(EXL5 和EXL6)以 及CYP98A8 和CYP98A9 酶是合成酚类物质前体所需的。分析结果证明了AMS在协调孢粉蛋白生物合成和花粉壁形成中的核心作用。基因和蛋白之间的相互作用调节形成复杂的调控网络，ZHANG 等[20]报道了1 个功能不正常的拟南芥DYT1雄性不育突变体，该突变体表现出异常的花药形态，绒毡层细胞高度液泡化，且缺乏正常的细胞质，突变体无法完成减数分裂胞质分裂并最终崩溃，不能形成花粉而导致雄性不育。DYT1 蛋白与拟南芥AMS 蛋白具有很高的相似性，可调控参与花药绒毡层细胞的分化和发育过程，DYT1促进正确的绒毡层以发挥其正常功能，之后AMS和MS1进一步调节绒毡层细胞功能以支持正常的小孢子发育，提出DYT1位于调控网络中AMS和MS1的上游。GU 等[21]利用染色质免疫沉淀(CHIP)分析明确了AMS是DYT1的下游调控基因。XIONG等[22]通过酵母双杂交和电泳迁移率变动分析(EMSAs)证明MS 188 与AMS 形成复合物，CYP703A2(孢粉蛋白合成途径中充当脂肪酸羟化单加氧酶)的表达可以通过ams突变体中MS188水平的升高部分恢复，表明MS188与AMS协同激活CYP 703A2在植物绒毡层生物合成中的作用。

绒毡层发育的遗传学研究证明存在DYT1-TDF1-AMS-MS188的分子调控通路[23]。DYT1、TDF1和AMS在绒毡层的早期发育中起作用，而MS188和MS1在绒毡层的后期发育中起作用。这些转录因子除激活其他转录因子的表达外，还调节许多生物学过程，AMS可能调节参与花粉壁形成的脂质转移蛋白和E3 泛素连接酶，从而降解先前过程中产生的蛋白。FERGUSON 等[24]研究表明：AMS在早期和晚期花粉发育过程中均表现出复杂的调控表达并具有迄今未表征的双重作用；进一步研究绒毡层功能的转录调控，表明反馈回路和调节的复杂网络对于控制花药绒毡层中瞬时基因表达以产生可育的花粉至关重要。

2.2 AMS 同源基因TDR 调节水稻雄性不育

水稻(Oryza sativa)是人类的粮食作物，可养活近一半的全球人口，而且还是促进植物科学研究的理想单子叶植物模型。目前水稻中已经报道参与小孢子发育的bHLH 转录因子包括UDT1(OsbHLH164)、EAT1/DTD (OsbHLH141)、bHLH142/TIP2 (OsbHLH142)和TDR1 (OsbHLH5)等，他们大部分在绒毡层细胞程序性死亡和花粉形成过程中起关键作用，其突变植株会导致花粉形成异常，进而引起雄性不育[25]。这些转录因子的功能异常所引起的细胞雄性不育在细胞水平上具有一定的相似性。

TDR与拟南芥中的AMS是直系同源基因，LI 等[26]首次报道了水稻雄性不育突变体tdr的分离和表征，发现该TDR基因优先在绒毡层中表达，并编码1 个假定的基本螺旋—环—螺旋蛋白。通过染色质免疫沉淀分析和电泳迁移率变动分析，得出编码Cys 蛋白酶和蛋白酶抑制剂的OsCP1和Osc6可能是TDR的直接靶标，后续研究表明OsC6 蛋白是TDR的直接靶标[27]。水稻tdr突变体花粉壁的形成发生明显的改变[28]，花药中的脂肪酸、伯醇、烷烃和链烯烃等含量异常增加。TDR除具有促进绒毡层PCD的功能外，还可能在水稻花粉发育过程中的几个基本生物学过程中发挥关键的调节作用。GAMYB和UDT1在早期阶段可并行调节花药发育，并可能积极激活TDR的表达[29]。TDR和EAT1相互作用，直接调节编码天冬氨酸蛋白酶的OsAP25和OsAP37的表达[30]，对水稻花药发育过程的细胞程序性死亡调控网络提供了有利的研究工具。F-box 蛋白Os-ADF 作为TDR的直接靶标之一，在水稻绒毡层细胞的发育和花粉形成中起着至关重要的作用[31]。水稻基本螺旋—环—螺旋(bHLH)蛋白TDR 相互作用蛋白2 (TIP2)在早期花药发育过程中，作为分生组织过渡和分化的关键开关，是细胞程序性死亡的主要调控因子[32-33]。TIP2是与TDR相互作用的另一种bHLH，作用于UDT1的下游，但在TDR和EAT1的上游，而TIP2可以与TDR形成二聚体以通过与其启动子结合来进一步激活EAT1转录。最新的研究[34]结果表明：TIP3在调控花粉外壁形成中发挥着重要的作用，TIP3或TIP3与TDR的相互作用可能直接或间接激活特定的下游基因来调节水稻的绒毡层降解和花粉壁形成，为杂交水稻雄性不育的研究提供新的育种思路。

2.3 AMS 基因调节甜瓜雄性不育

甜瓜(Cucumis meloL.)是全世界广泛种植的葫芦科经济作物之一，相对于其他的园艺作物，瓜类表现出很大的杂种优势[35]。在水稻[36]、番茄[37]和辣椒[38]等作物上多个核隐性遗传雄性不育基因已经被精确定位，且生产上已有雄性不育突变体的利用，但关于甜瓜雄性不育的报道很少。

甜瓜雄性不育突变体ms5最早由美国Clause种子公司在抗白粉病品种PMR45 育种过程中发现，并应用于杂交一代制种中[39]。甜瓜雄性不育(ms5)突变体候选基因AMS的定位和初步分析结果表明：AMS是其雄性不育的可能候选基因[40]。为探索甜瓜细胞核雄性不育系ms5花药败育发生的时期及不同时期雄花物质含量与雄性不育之间的关系，有学者研究了不育株ms5的花药发育结构，且发现不育株可溶性糖、蛋白质及游离脯氨酸含量均在花药发育四分体时期出现明显变化[41]。曾双等[42]针对如何筛选出甜瓜AMS基因进行了研究，结果表明：AMS基因启动子在光、逆境、激素和化合物质等相关方面都有其作用元件，并利用酵母单杂交筛选到与AMS基因启动子顺式作用元件高度结合从而编码甜瓜雄性不育基因表达的LOC103496635 蛋白。但关于AMS转录因子是如何调控甜瓜雄性不育的过程仍不是很清楚。

2.4 AMS 基因调节辣椒雄性不育

辣椒(Capsicum annuumL.)是一种重要的园艺作物。雄性不育品系的使用可实现高效的商业杂交辣椒种子生产。尽管雄性不育系已广泛用于辣椒育种[38]，但对花粉败育的机理知之甚少。

通过辣椒花药转录组数据分析[43]，结合VIGS 基因沉默技术，筛选得到导致部分植株花粉败育的辣椒育性相关基因CaAMS，该基因存在2种剪接体，CaAMS-1在单核早中期表达量最高，而CaAMS-2的最高表达量则出现在四分体时期。从辣椒花芽中分离并鉴定拟南芥AMS同源转录因子CaAMS，使用VIGS 评估CaAMS的功能[44]，发现在CaAMS基因沉默的花药中，LAP5、MS1、DRL1、ABCG26和CYP703A的表达水平大大降低，辣椒花丝缩短，雄蕊干枯，花粉败育，与拟南芥中ams突变体的表型类似。在CaAMS突变植株中，一些涉及花粉外壁合成的基因被下调，且CaAMS优先在四倍体和单核阶段的绒毡层中表达，表明CaAMS可通过调节复杂的遗传网络在辣椒绒毡层和花粉发育中起重要作用。

2.5 其他植物AMS 基因克隆与功能研究进展

除上述几种植物外，在其他植物中也有关于AMS基因的报道。对葡萄花药发育相关基因表达进行分析[45]，获得在花蕾不同发育时期表达差异显著的VvAMS基因，对葡萄VvAMS进行初步的序列分析，发现VvAMS基因编码的蛋白含有bHLH.MYC-N 端结构域，属于bHLH 转录因子MYC 亚家族。但是葡萄花粉败育并不是由AMS基因突变直接引起，推测AMS基因的表达可能影响下游MS2基因的表达，从而导致花粉败育。而关于葡萄中AMS基因的调控机制还有待进一步的研究。袁巧玲[46]初步探讨了AcAMS与洋葱细胞质雄性不育的关系，洋葱遗传体系尚未建立完善，利用VIGS 技术获得部分不育与完全不育的转基因植株，洋葱AcAMS可能与细胞雄性不育有关。洋葱细胞质雄性不育系SA2 及其保持系SB2 中，AcAMS主要在洋葱的花药中表达，且在花粉母细胞时期和四分体时期表达差异显著，推测由此导致SA2的不育。AcAMS基因与其他同源性较高的物种AMS序列分析表明：它们存在bHLH 结构域，同源性均大于50%，表明AMS基因在物种进化上的高度保守性。金玲等[47]克隆大豆GmAMS基因，通过GUS 融合表达分析GmAMS的时空表达，表明其主要在花药早期表达，并发现5 个参与花药发育的重要互助蛋白基因(GLYMA12G18960、GLYMA20G29600、GLYMA13G32360、GLYMA10G38255和GLYMA08-G44950)。GmAMS的异常表达影响其他花发育关键基因的表达，继而影响大豆花粉的正常发育。

3 展望

目前在不同植物中鉴定出的AMS具有高度的保守性，其在植物花药发育调控上起着至关重要的作用，与植物花粉败育密切相关。绒毡层发育和小孢子母细胞的发育是花药发育过程至关重要的环节，尽管绒毡层发育的确切机制仍然有待阐明，但已经鉴定出与绒毡层形成、发育和程序性细胞死亡(PCD)有关的几种基因，综合以上AMS基因的相关报道可知：AMS突变体的绒毡层细胞和中层细胞在小孢子母细胞减数分裂时扩张，进而阻止正常的细胞程序性死亡(PCD)，影响小孢子母细胞发育过程，花粉外壁不能正常发育，花粉形成异常，最终导致植株的雄性不育。目前在拟南芥和水稻上的研究比较深入，两者具有很高的相似性，已有基本的调控网络，拟南芥：DYT1-TDF1-AMS-MYB80-MS1[23]，水 稻：DsMADS3-MSP1-UDT1-TDR-EAT1-OsAP25/37[48]。系统发育分析支持拟南芥DYT1和水稻UDT1基因属于同一分支，均在减数分裂和绒毡层程序死亡中担任关键的角色[20]。因此，水稻UDT1-TDR基因和拟南芥DYT1-AMS基因很可能代表对正常花药发育至关重要的进化保守调控通路。而对甜瓜和辣椒的研究较浅，AMS可能只间接调节甜瓜雄性不育，目前未有深入研究，应进一步研究以确定AMS转录因子的遗传功能。辣椒的研究结果表明：CaAMS通过调节复杂的遗传网络在辣椒绒毡层和花粉发育中起重要作用，这更进一步明确了AMS基因在不同物种中的相似调控。在洋葱、大豆和葡萄上都进行了AMS基因的克隆及同源序列分析，初步得出AMS与花粉败育有关，但其具体的分子机制仍需进一步研究。本文综述了AMS基因在不同植物花药发育过程的调控作用，期望通过转基因技术来创制和筛选突变体，进一步解析AMS在整个花药发育过程中的分子机制，为植物雄性不育新种质的选育提供理论指导。