pSynGAP1在脂多糖诱发脓毒症小鼠远期认知障碍中的作用

袁 亮，高炟鹏，嵇 晴

0 引 言

脓毒症患者出院后会出现不同程度的远期认知障碍及心理缺陷[1-2]；且早期炎症反应会增加未来患阿尔茨海默病的风险[3]。但机制有待进一步阐明。蛋白质组学技术如同位素标记相对或绝对定量(iTRAQ)的发展极大地提高了疾病的检测能力，现已广泛用于探索各种疾病的分子标记和机制[4]。尽管目前通过对单个基因或蛋白质的研究已经揭示了炎症引发神经行为异常的各种机制，但尚缺乏对海马蛋白组学进行系统分析。因此，本研究旨在探讨LPS暴露后导致的远期神经行为改变及其机制，为炎症致远期认知功能损伤的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选取雄性C57BL/6小鼠90只3～4月龄，体重29～35 g，由东部战区总医院比较医学科提供[实验动物合格证号：SYXK(军)2017-0037]，饲养于湿度50%，温度25 ℃，12 h灯照的环境中，自由摄水，饮食。所有小鼠随机分为：等渗盐水组(对照组，n=20)、LPS组(LPS组，n=40)与LPS + Roscovitine(LPS+R组，n=40)。对照组小鼠腹腔注射等渗盐水(10 mL/kg)；LPS组小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)；LPS+R组腹腔注射LPS(5 mg/kg)。所有小鼠注射完成后饲养12个月。对照组和LPS组在行为学检测完成后，取海马组织，采用iTRAQ技术寻找发挥重要作用的蛋白靶点。在行为学检测前3 d开始直至行为学检测结束当天，LPS+R组每天腹腔注射Roscovitine(20 mg/kg)；对照组和LPS组每天腹腔注射等量等渗盐水。

1.2旷场实验利用旷场实验评估实验动物的运功能力和焦虑样行为。实验在安静的环境中进行，将小鼠放入实验箱(50 cm × 50 cm × 40 cm)中自由探索5 min并进行摄像。记录其探索运动总路程以及在中央格停留的时间。每只小鼠实验结束后以75%乙醇棉球擦拭场地以免气味干扰。

1.3糖水消耗实验实验前，安静房间内训练动物适应糖水。每笼同时放置2枚水瓶均装有1%蔗糖水，放置24 h。实验时给予每只小鼠事先定量的1%蔗糖水和纯水，12 h后交换2枚水瓶位置，24 h后称重，计算动物的糖水消耗比例(糖水消耗/总液体消耗×100%)。

1.4条件性恐惧实验实验分为训练和测试2部分。将小鼠放入测试箱(32 cm × 25 cm × 25 cm)自由探索180 s，接着给予30 s声音刺激(65 dB，1000 Hz)，在声音刺激的最后2 s予电刺激(0.8 mA)，再记录30 s的僵直行为。场景性条件恐惧测试在训练后24 h进行.将小鼠置于原实验箱内，不予声音刺激和电刺激，监测5 min内的僵直行为；2 h后开始声音条件性测试，先在新环境中适应180 s，再给予180 s相同的声音刺激并监测僵直行为。记录小鼠场景性僵直时间和条件性僵直时间。

1.5强迫游泳实验在透明玻璃缸(直径15 cm、高度30 cm)中加满水(20～24 ℃)。将小鼠放入水中游泳6 min，观察4 min内小鼠静止不动行为累计时间(s)。静止不动行为指大鼠除了为避免没入水中而向上的主动运动外，无其他行为。

1.6蛋白质组学行为学检测完成后，每组随机抽取6只小鼠，腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后处死，快速收集小鼠海马组织。用磷酸缓冲盐水冲洗，在液氮中冷冻。提取和溶解组织后，使用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex试剂盒标记胰蛋白酶肽。对照组使用iTRAQ tags 113和114进行标记，LPS组使用tags 115和116进行标记。用Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher Scientific)进行iTRAQ标记和串联质谱分析[4-5]。

1.7Western blot检测每组取4只小鼠海马组织，加裂解缓冲液，冰上裂解，4 ℃离心，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸 5 min 变性，经 SDS 凝胶电泳，转至 PVDF 膜。用5%脱脂乳在Tris缓冲液中封闭2 h后，之后加anti-SynGAP1(1∶500; APExBIO)、Anti-phospho-SynGAP (1∶500; bs-10392R), and GAPDH (1∶5000; Sigma St. Louis) 4 ℃过夜。充分洗膜后，加HRP结合二抗(1∶5000; Santa Cruz Biotechnology)室温孵育2 h。电化学发光(ECL) 显影后，用Image J软件(NIH Image, Bethesda)分析灰度值，对海马SynGAP1和pSynGAP1进行可视化和定量分析。

1.8CA1区局部场电位记录每组取5只小鼠使用2%戊巴比妥盐溶液(40 mg/kg，Sigma)腹腔注射麻醉后，将其头部固定在立体定位仪上实施手术，整个手术过程中使用体温维持仪将小鼠体温维持34～36 ℃。在小鼠海马CA1区(前囟后2.1 mm、旁开1.5 mm、深度1.5 mm)处置入8通道的微电极装置。所有电极均连接于微型连接器，并用牙科丙烯酸材料固定在颅骨上。术后经历7 d恢复期后将小鼠放入旷场中自由探索同时记录局部场电位，记录3 min。所有的数据均是通过Neuroexplorer(Plexon Inc., Dallas, TX)软件分析。

2 结 果

2.1 对照组和LPS组小鼠死亡率比较对照组无小鼠死亡，LPS组小鼠存活率为62.5%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2两组差异性蛋白质之间相互作用网络图显示Syngap1处于蛋白质之间相互作用中心，见图2。

2.3行为学实验结果比较旷场实验中，与对照组相比，LPS对运动总距离与中央格停留时间无影响(P>0.05)。条件相关恐惧实验中， 与对照组相比，LPS组小鼠场景相关僵直时间显著下降(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+R组小鼠僵直时间显著增加(P<0.05)。听觉相关的恐惧实验中，各组间的声音相关僵直时间差异无统计学意义(P>0.05)。强迫游泳试验中，与对照组相比，LPS组小鼠不动时间显著增加(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+R组小鼠不动时间显著降低(P<0.05)。糖水消耗实验中，与对照组相比，LPS组小鼠对糖水的偏好度显著降低(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+R组小鼠对糖水的偏好度显著增加(P<0.05)。见表1。

2.4海马组织Syngap1和pSyngap1的表达水平变化与对照组比较，LPS组海马组织中Syngap1差异无统计学意义(P>0.05)，而pSyngap1的表达显著降低(P< 0.05)，见图3。

图 1 LPS对存活率的影响

图 2 两组差异性蛋白质之间相互作用网络图

表 1 各组小鼠行为学实验参数比较

与对照组比较，*P<0.05

2.5海马pCamkII、pSynGAP1表达变化的比较与对照组比较，LPS组海马组织中pCamkII及pSynGAP1显著降低(P<0.05)，而Roscovitine可逆转pCamkII及pSynGAP1显著降低(P<0.05)，见图4。

2.6在体海马CA1区神经振荡的比较与对照组比较，LPS组小鼠海马CA1区theta与gamma振荡显著降低，而Roscovitine可逆转theta与gamma振荡显著降低(P<0.05)，见图5。

与对照组比较，*P<0.05;与LPS组比较，#P<0.05

与对照组比较，*P<0.05；与LPS组比较，#P<0.05

3 讨 论

全身炎症可介导远期认知功能损伤，但机制尚不清楚。本实验通过蛋白质组学分析显示，LPS暴露后远期神经行为出现异常，且pSynGAP1的表达异常可能是介导LPS暴露后海马神经网络稳态失衡及远期神经行为异常的重要原因。

临床研究发现：重症监护病房中脓毒症患者会表现出明显的认知障碍[1]。最近的流行病学研究报告显示，脓毒症存活患者发生远期认知能力下降的风险增加[6]。其中病理性特征改变包括神经炎症、突触丢失和脑萎缩[7-8]。在脓毒症动物模型中(腹腔注射LPS或盲肠结扎和穿刺)，发现淀粉样前体蛋白和淀粉样β蛋白在神经细胞内积累，继而导致认知功能障碍[3]。利用定量蛋白质组学方法深入诠释各种细胞内的生理过程，以及疾病如何影响这些过程，从而识别出新的生物标志物[4]。特别是基于LC-MS的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的发展，可全面了解蛋白质组学和数万个磷酸化变化[9]。本研究LPS暴露后凋亡、线粒体功能障碍和微管相关蛋白相关的多个细胞信号级联反应在LPS暴露后显著上调，其中包括Cdk11b、Atp8a1、Iscu、Map1b、Dctn1、Map2和Ank2磷酸化增加。这些结果与之前的文献发现的相一致，即细胞凋亡、线粒体功能障碍和微管相关蛋白的紊乱会破坏海马的学习记忆功能[10-11]。此外，LPS暴露的小鼠中有一些突触相关的蛋白质发生改变，如Syngap1、Bsn、Shisa6、Synpo、Pclo、Ppp1r9b和Dlgap2等，突触功能障碍也被广泛认为是AD病程中最早发生的神经退行性病变[8]。

根据蛋白质-蛋白质相互作用分析，本实验发现SynGAP1处于突触可塑性改变的中心位置。SynGAP大多分布在谷氨酸能神经元的突触后间隙，通过结合突触中AMPA受体来调节突触强度[12]。SynGAP与突触后支架蛋白结构相似，突触后支架蛋白是维持突触密度、突触生理功能和长时程增强的重要因素。SynGAP障碍与许多神经精神疾病有关，如智力残疾、自闭症等[13]。已有研究证明，形成长期记忆的过程中，PSynGAP1对于AMPA受体结合和树突棘生长是必不可少的，而CaMKII抑制剂可抑制SynGAP扩散从而防止突触发生长时程增强，即pSynGAP1受CaMKII调控，从而影响突触可塑性[14]。本实验中使用Cdk5抑制剂Roscovitine上调pSynGAP1水平，改善认知障碍。同时，本研究表明Roscovitine能够逆转LPS诱导的海马突触丧失。大脑功能都是基于特定的神经网络振荡完整性，其中，θ振荡参与各种认知过程，尤其是海马相关的记忆过程，而γ振荡与感觉、学习和记忆相关[15]。本研究发现LPS暴露的动物在运动过程中θ和γ振荡明显降低，但Roscovitine可以逆转LPS引起的海马振荡障碍和神经行为异常，说明海马神经振荡网络完整性需要pSynGAP1参与。

综上所述，本研究发现pSynGAP1介导的海马振荡网络紊乱在LPS诱导的神经行为异常中发挥关键重要作用，提示pSynGAP1可作为全身炎症相关性疾病潜在治疗靶点。