高效液相色谱法测定大蒜素片中DADS和DATS的含量

李天昊 李若琦 黄雪婷 陈梅兰*

(1．浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015；2. 江苏常州大学，常州 213164)

在我国，大蒜素是一类运用广泛的抗菌药，有抗氧化的作用，能调节人的心脑系统的功能，并且在降低血压血脂以及抗癌方面也有一定的效果。大蒜素是大蒜中具有高度生物活性的主要成分的总称，学名为二烯丙基硫代亚磺酸酯，化学式为C6H10OS2，是否下标常见于葱属植物中，在新鲜大蒜以及洋葱等植物里存在。纯品大蒜素是无色的油状物，有大蒜的特殊气味，微溶于水，易溶于乙醇、苯、乙醚、正己烷等有机溶剂中[1]，在热、碱中不稳定，在酸中较为稳定[2]。

但是新鲜大蒜产生的大蒜素极不稳定, 可迅速降解为挥发性的二烯丙基硫化物(Diallyl sulfide, DAS) 、二烯丙基二硫醚(Diallyl disulfide, DADS) 和二烯丙基三硫醚(Diallyl trisulfide, DATS) 等多种有机硫化合物[3]，其中DADS和DATS是与大蒜活性的主要成分[4]。DADS是一种有机硫化合物，有强烈的蒜臭味，也是大蒜油的挥发性成分，具有较好的抗癌作用[5]。DATS是由大蒜粉碎产生的挥发性有机硫化物化合物,具有其特殊的气味,不溶于水和乙醇，可与乙醚混溶。DADS和DATS具有抗炎、抗氧化和免疫调节等药用效果[6-8],因此常被制成药片作为药用治疗，由于DADS和DATS是大蒜素中起作用的活性物质，因此药片中DADS和DATS的含量有极其重要的意义。

目前关于大蒜中DADS、DATS等系列硫醚化合物测定的方法有很多, 主要有：紫外衍生化法、气相色谱-质谱联用法[9，10]、定硫法[11]、高效液相色谱法[12]、薄层扫描法[13]等方法，但大都是对大蒜中单一成分的测定[14]。气相色谱-质谱联用法需要较高的温度，而大蒜素在较高温度下可能会分解，导致实验结果的误差；虽然定硫法方法简便、快捷、试剂消耗量少【15】，但是其氧化剂用量、酸度、沉淀剂的用量都会对这次实验的测定结果有影响。我们采用高效液相色谱法(HPLC)对大蒜素片中的DADS和DATS进行测定实验，该方法操作方便简单，精确度高。

1 仪器与材料

仪器：Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色谱仪(包含二元泵、紫外/可见检测器等，美国赛默飞世尔科技公司)；恒温磁力搅拌水浴锅；超声波清洗机；布氏漏斗。

材料：超浓缩大蒜片(200mg/片，杭州绿宝食生物科技有限公司)；DADS(浓度为85%，macklin试剂)；DATS(浓度为65%，macklin试剂)；超纯水(≥18.2M·cm，美国Millipore有限公司)；甲醇作为色谱纯，甲酸作为分析纯。

1.1 样品的前处理

取超浓缩大蒜素片，将其研磨成粉，精确称量8.0 g后倒入500 mL锥形瓶中，加入160 mL超纯水，溶解摇匀，加入3至8滴浓度为50%的氢氧化钠溶液，调节pH至7。将混匀的上述液体放入恒温磁力搅拌水浴锅中，设置温度为60℃，转速100 r/min，60 min 后，冷却至室温，再加入乙醇320 mL，充分摇匀。调节水浴锅温度到65℃，调节转速为120r/min，加热60 min，过程中，每隔5 min给锥形瓶开塞放气。取出后，冷却到室温，使用布氏漏斗抽滤。取480 mL滤液放入1000 mL分液漏斗中，加入160 mL正己烷，缓慢振荡混匀2 min后萃取。静置后分层，若分层不明显或者乳化层过厚，则滴入甲醇1～5 mL。待分层彻底后，取上层清液测定。重复以上操作获得2份平衡样品。

1.2 标准溶液的配制

取为浓度为85%的DADS和65%DATS适量，用正已烷配制1000 mg/L的DADS和DATS样品。使用时用正己烷分别配制成1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L的一系列标准溶液。DATS分别配制1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的一系列标准溶液，置于4℃以下冰箱储存备用。

1.3 色谱条件

使用HypersiL ODS C18柱(4.6x250mm，5μm)为分离柱；以为甲醇、水和甲酸的混合溶液，比例为(85:15:0.1)为流动相。流速为1.0 mL/min；检测波长为225 nm；柱温：25℃；进样量：25 μL。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

为了确定DATS以及DADS的最大吸收峰，进行全波长扫描，波长在210nm和225 nm时有最大吸收峰，但考虑甲醇作流动相时，210nm波长甲醇的峰干扰很明显，因此选择225nm波长。

2.2 样品溶剂的选择

为了选择更好的样品溶剂，将研磨好的样品分别用淋洗液(甲醇-水-甲酸，85∶15∶0.1)、甲醇和正已烷按1.1方法进行处理，再色谱分析。结果发现只有正已烷作溶剂时，DADS与DATS才出现色谱峰，淋洗液和甲醇作溶剂并不出峰。结果见图1。实验最后选用正已烷作为溶剂。

结果表明，DADS和DATS在甲醇和淋洗液定容的标准溶液中不存在出峰，在正己烷中有出峰。这可能是因为两个物质不能溶于淋洗液和甲醇中，但却能溶解在正己烷中。故只在正己烷中检测到它们的出峰。

2.3 方法学考察

按1.3的色谱条件，分别进DADS和DATS系列样品溶液。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，另取浓度为4.0 mg/LDADS和DATS分别进样7次，计算方法的精密度。结果见表1。从表1可看出，方法可靠。

表1 线性方程、检测限及相关系数

图1 正己烷、淋洗液与甲醇作溶剂的色谱图

2.4 样品的测定及加标回收率

取按1.1 前处理方法处理好的样品溶液进行色谱分析，典型的色谱图见图2。

图2 DADS和DATS的色谱图

对样品进行加标处理后，加标回收率见表2。

表2 DADS和DATS的加标回收率和相对标准偏差

3 结论与讨论

使用HypersiL ODS C18柱(4.6x250mm，5μm)为分离柱；以为甲醇、水和甲酸的混合溶液，比例为(85∶15∶0.1)为流动相，波长为225nm时，DADS和DATS获得较好的分离，加标回收率实验表明方法准确可靠，精密度较好，可应用于超浓缩大蒜素片中的DADS以及DATS的测定。