阜阳地区2018-2019年柯萨奇病毒A6型感染手足口病临床特征及病原学分析

孟献萍，汪作琳，吴婷

(阜阳职业技术学院医学检验教研室，安徽 阜阳 236000)

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一种好发于5岁以下儿童的常见传染病，患儿以发热及手、足、口腔部位疱疹、斑丘疹为主要症状，严重时可引起心肌炎、脑膜炎、肺水肿等并发症，危及患儿生命[1,2]。HFMD由人肠道病毒引起，既往报道以肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(Cox-16A)感染多见。近年来，柯萨奇病毒A组6型(Cox-A6)感染所致HFMD的报道越来越多，但Cox-A6目前并未纳入《全国手足口监测方案》监测类型，因此其感染引发的公共卫生问题值得进一步研究[3,4]。本研究通过回顾性分析2018年1月至2019年12月阜阳地区确诊的700例HFMD患儿的临床特征、并发症及其病原学特征，旨在为诊治及防控提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：符合《手足口病诊疗指南》(2018年)[5]中HFMD诊断标准；首次发病且入院前未接受相关治疗；行咽拭子或粪便标本病毒检测；病毒核酸检测阳性；临床资料完善；家属已签署知情同意书。

排除标准：患有幼儿急疹、水痘、带状疱疹等其他儿童发疹性疾病；合并严重细菌感染；患有先天性心脏病、重要脏器功能不全、恶性肿瘤、消化道溃疡、支气管哮喘等其他疾病。

本组HFMD患儿700例，均来源于阜阳地区公立医院，其中包括1家责任单位、2家合作单位及5家哨点医院。

1.2 研究方法

1.2.1资料收集 通过电子病历系统，收集患儿人口统计学信息(包括性别、年龄、发病时间、住院时间等)、临床症状体征(包括发热、皮疹、各系统受累情况)、实验室结果(包括入院48 h内血常规、肝肾功能、心机酶谱、核酸鉴别等)、影像学检查(包括心电图、脑电图、头颅磁共振等)、治疗情况(包括抗感染、降颅内压、糖皮质激素应用、营养心肌等)、预后(包括并发症、治愈出院、后遗症)等信息。

1.2.2标本处理 所有患儿留取入院72 h内咽拭子或粪便标本，其中咽拭子标本选择专用病毒采样管采样并保存备用；粪便标本取0.2 g于EP管中，加1.5 mL生理盐水震荡混匀，静置10 min左右后，离心5 min，转速8 000 r/min，然后取200 μL上清液于EP管备用。

1.2.3核酸提取及鉴定 选择德国罗氏公司MagNA Pure LC 2.0自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂盒提取病毒RNA，严格按试剂盒操作，主要步骤包括裂解-核酸结合-洗涤-核酸洗脱；采用实时荧光定量PCR法对标本进行EV71、Cox-16A、Cox-A6等分型检测。

1.2.4Cox-A6 基因扩增及测序 选择one step RT-PCR kit 试剂(德国QIAGEN公司)，采用Veriti PCR仪(美国ABI公司)对Cox-A6阳性标本VPI 全基因序列(915 bp)进行扩增，扩增条件、引物序列、反应体系参考文献[6]，扩增阳性产物纯化后，送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，Genebank比对分析测序结果。

1.2.5生物学信息分析 应用Geneious primer生物信息学软件行同源性比对分析，采用MEGA 6.0 软件中Neighbor-joining法构建进化树，建树可靠性评估应用Bootstrap值(1 000次)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 病原学检验结果

700例阳性样本中，共检出EV71阳性283例(40.43%)、Cox-A16阳性174例(24.86%)、Cox-A6阳性143例(20.43%)。2018年、2019年各肠道病毒阳性构成比比较，差异无统计学意义(χ2=1.222，P>0.05)。见表1。

表1 700例手足口病患儿病原学检验结果[例(%)]

2.2 临床特征分析

由表2可知，143例Cox-A6感染患儿中以男性多见(91例，占比63.64%)；年龄集中在3岁以内(120例，占比83.92%)；发病季节主要集中中6-8月(71例，占比49.65%)；住院时间多在7 d以内(89例，占比62.24%)；临床表现中发热(体温≥37.5 ℃)139例(97.20%)；皮疹/疱疹主要集中于口咽部(131例，占比91.61%)、手(126例，占比88.11%)、足(117例，占比81.82%)；胃肠道反应以纳差(32例，占比22.38%)、呕吐(26例，占比18.18%)居多；神经系统反应多见于精神差(51例，占比35.66%)、惊厥(39例，占比27.27%)；其他症状包括咳嗽61例(42.66%)、扁桃体肿大55例(38.46%)、脱屑52例(36.36%)、脱甲47例(32.87%)。Cox-A6感染重症病例可达41例(14.69%)。

表2 Cox-A6感染手足口病患儿临床特征分析(n=143)

续表2

2.3 实验室检查结果

143例Cox-A6感染患儿中，白细胞升高111例(77.62%)、淋巴细胞升高98例(68.53%)、血小板升高59例(41.26%)；谷丙转氨酶升高16例(11.19%)、谷草转氨酶升高31例(21.68%)、尿素升高3例(2.10%)、肌酐升高1例(0.70%)；肌酸肌酶同工酶升高49例(34.27%)；C反应蛋白升高81例(56.64%)、乳酸脱氢酶升高77例(53.85%)、随机血糖升高9例(6.29%)。见表3。

表3 Cox-A6感染手足口病患儿实验室检查结果

2.4 心、脑电图及影像学检查

143例Cox-A6感染患儿中，心电图检查示窦性心律不齐8例(5.59%)、房室传导阻滞2例(1.40%)、窦性心动过速5例(3.50%)、T波改变11例(7.69%)；脑电图检查示弥漫性慢波增多7例(4.90%)、枕区尖慢波散发5例(3.50%)、θ节律3例(2.10%)；头颅MRI检查示脑室后角旁信号异常4例(2.80%)、脑桥及延髓信号异常5例(3.50%)、脑桥及脑干信号异常2例(1.40%)、脑干信号异常1例(0.07%)。

2.5 治疗情况

参照2018年版《手足口病诊疗指南》，患儿入院早期予以利巴韦林静脉滴注、α干扰素雾化，并给予氧疗、降温、镇静、降颅内压、血管活性药物等对症支持治疗，重症患儿必要时联合静脉丙种球蛋白、糖皮质激素、机械通气治疗。

2.6 并发症及预后情况

143例Cox-A6感染患儿中病毒性脑炎6例(4.20%)、神经源性肺水肿1例(0.70%)、肺炎3例(2.10%)、心肌炎4例(2.80%)、心律失常2例(1.40%)、循环衰竭1例(0.70%)，总并发症发生率11.89%(17/143)；住院时间4～14 d，平均住院时间(8.02±2.16)d，其中138例(96.50%)治愈出院，5例(3.50%)残留不同神经系统后遗症(偏瘫、语言功能障碍等)。

2.7 Cox-A6基因特征

随机选取24株Cox-A6毒株测序，同GeneBank数据库其他地区Cox-A6 VP1基因全序列构建基因进化树，与参考序列AY421764核苷酸同源性83.65%～86.19%、氨基酸同源性94.76%～96.52%；其中13株Cox-A6高度同源(核苷酸同源性97.86%～100%、氨基酸同源性98.81%～100%)且聚集成簇，与2016年上海KY972297参考株核苷酸同源性达98.26%～99.38%；9株Cox-A6高度同源(核苷酸同源性96.54%～99.82%、氨基酸同源性97.71%～100%)且聚集成簇，与2017年云南LC413165.1参考株核苷酸同源性达97.35%～98.69%，其余2株分别与2017年广东MG385785.1(核苷酸同源性97.75%)、MH018543.1高度同源(核苷酸同源性98.29%)。

根据基因型划分，阜阳市2018～2019年流行毒株均分布在E2分支。

3 讨论

HFMD是我国法定丙类传染病，主要经密切接触及粪口途径传播，可导致重大公共卫生问题，自2008年以来，HFMD就在我国多个地区持续流行，给儿童健康带来严重威胁[7]。疱疹液被认为是HFMD病毒核酸检出率最高的样本，但因该病发病早期疱疹液体量偏少、采集困难，临床常通过咽拭子或肛拭子进行病毒核酸检测[8]。EV71、Cox-A16是我国自2008年来引起HFMD的主要病原体，但近年来，Cox-A6型HFMD报道越来越多，其在2012年已成为深圳市HFMD第二大病原[9]。本研究结果显示，阜阳地区经咽拭子或肛拭子行病毒核酸检测的HFMD患儿700例阳性标本中，EV71、Cox-A16、Cox-A6阳性检出率分别为40.43%、24.86%、20.43%，其他病毒阳性共14.29%，其中Cox-A6型2019年(21.98%)虽较2018年(18.65%)有所上升，但差异无统计学意义，提示阜阳地区2018～2019年HFMD仍以EV71、Cox-A16为主要病原体，而Cox-A6相比其他病原体也占较高比例，为第三大病原。

本研究Cox-A6感染手足口病患儿中男性占63.64%，较女性36.36%偏多，可能与性别引起的手足口基因易感性差异有关[10]；患儿集中在3岁以内(83.92%)，相较EV71、Cox-A16感染所致的HFMD患儿年龄偏小[11]；发病季节集中在6-11月(71.33%)，与既往报道的流行高峰期7-11月份类似[12]。Cox-A6感染可引起非典型HFMD，本研究中主要症状包括皮疹(100%)、发热(97.20%)、咳嗽(42.66%)、扁桃体肿大(38.46%)、精神差(35.66%)、脱屑(36.36%)、脱甲(32.87%)、惊厥(27.27%)、纳差(22.38%)等。多数Cox-A6感染HFMD患儿症状较轻，可于数天内消退，但仍有部分可出现神经系统受累、心肺功能衰竭，发展成重症病例[13]。本研究结果显示，Cox-A6感染患儿重症病例达18.88%，提示Cox-A6感染仍有较高的重症比例。

除临床症状外，实验室检查及影像学检查也是评估HFMD患儿病情严重程度的重要内容。本研究中Cox-A6感染致HFMD患儿白细胞升高(77.62%)、淋巴细胞升高68.53%)、血小板升高(41.26%)、C反应蛋白升高(56.64%)、乳酸脱氢酶升高(53.85%)均占较大比例，这些指标或可以用于HFMD辅助诊断，值得进一步分析。心肌酶中肌酸同工酶的升高(34.27%)也有一定比例，提示Cox-A6感染所致HFMD可导致一定心肌损伤；但患儿谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素、肌酐等指标升高比例相对较少，提示Cox-A6感染可能对肝肾功能影响较小，这与Zeng等[14]的报道类似。心电图检查中，窦性心律不齐、房室传导阻滞、窦性心动过速、T波改变等心电图异常虽有一定检出率，但均较少，可能与Cox-A6感染引起心肌损伤有关。此外，神经系统受累是导致HFMD发展成重症的重要原因，本研究中弥漫性慢波增多7例(4.90%)、枕区尖慢波散发5例(3.50%)、θ节律3例(2.10%)，可能与Cox-A6侵犯脑组织有关。头颅MRI检查显示脑室后角旁信号异常8例(5.59%)、脑桥及延髓信号异常5例(3.50%)、脑桥及脑干信号异常4例(2.80%)、脑干信号异常2例(1.40%)，可能与部分患儿Cox-A6感染累及延髓、中脑、小脑有关，但整体比例较少。

Cox-A6感染致HFMD患儿经规范治疗后，绝大多数(96.50%)可治愈出院，仅少数患儿存在神经系统后遗症(3.50%)，提示Cox-A6感染整体预后较好，但仍应重视神经系统、心肺功能受损等重症病例早期诊治，进一步降低后遗症风险。此外，本研究对Cox-A6进行VP1基因特征分析，发现该地区流行毒株主要分布在E2分支，有13株与2016年上海KY972297参考株高度同源，9株与2017年云南LC413165.1参考株核苷酸高度同源，提示Cox-A6 E2谱系可能在南部、中部地区出现循环、进化，而非局限于单一地区。王冰等[15]对沈阳市2013～2017年CoxA6型毒株进行VP1基因特征分析，结果显示流行毒株主要分布均位于D3上，这表明CoxA6型优势基因型别存在一定时空差异，可能对相关地区疫苗生产等提供一定指导。

综上所述，阜阳地区2018～2019年HFMD患儿中Cox-A6型为第三大病原，患儿年龄普遍偏小，其中男性患儿更多，主要临床症状可表现出皮疹、发热、咳嗽、扁桃体肿大、脱甲等，绝大多数预后良好，少数可出现严重并发症，且E2亚群是该地区Cox-A6流行优势株，加强相关监测对该病防控有重要意义。