芍药苷对腹膜间皮细胞α-SMA和CTGF的影响

张奡,曾碧珊，郭维文,陈河梅

(广东省第二中医院肾病科，广东 广州 510095)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是终末期肾衰竭患者的主要治疗方法之一，因操作简单，价格亲民而有着更广阔的推广前景。但长期腹膜透析会引起腹膜的形态和功能改变，腹膜纤维化(peritoneal fibrosis，PF)的发生，是病人退出腹膜透析的主要原因之一，且无有效的解决办法。尽管腹膜间皮细胞的间皮-间充质转变是导致腹膜纤维化的关键过程，但生物不相容的腹膜透析液是导致改变间皮细胞功能和增殖的原因，这些过程的基础仍然不清楚[1]。腹膜纤维化有两个因素，即纤维化过程本身和炎症。这两个因素之间的联系通常是双向的，每个过程都相互诱导[2]。因此，探讨腹膜透析相关腹膜纤维化的发生机制、从而寻找有效的治疗措施，是目前需要解决的一个问题。很多中药单药成分或中药复方制剂在改善腹膜纤维化方面获得了一定的疗效。

本研究通过观察芍药苷(paeoniflorin，PF)对人腹膜间皮细胞的影响，评价其防治腹膜纤维化的效果，为防治腹膜纤维化提供新的中药治疗依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

人腹膜间皮细胞(HMrSV5)(由中山大学附属第一医院肾内科肾脏病重点实验室惠赠)。

1.2 主要试剂与药物

芍药苷，由成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批号：s-010-17021；低钙腹膜透析液(42.5 g/L乳酸盐-G)，由百特医疗用品有限公司提供，批号：20023568。DMEM/F12 培养基：Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国；胎牛血清：Cellmax，赛澳美细胞技术(北京)有限公司，中国；胰蛋白酶：Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国；青霉素/链霉素：Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国；PBS pH7.2basic(1×)： Life Technologies,Thermo Fisher Scientific,美国 ；10×细胞裂解液：cell signaling technology,美国; 蛋白酶/磷酸酶抑制剂：cell signaling technology，美国; PVDF 膜：Millipore，美国; 丽春红：Sigmar-Aldrich，美国;α-SMA：Sigmar-Aldrich，美国；CTGF: Arigo Biolaboratories,中国；二抗：HRP 标记羊抗兔 IgG、HRP 标记羊抗鼠 IgG：Cell Signaling Technology，美国；化学发光液：Millipore，美国；DAPI：Sigmar-Aldrich，美国。

1.3 实验分组及方法

使用永生人HMrSV5细胞株，分为空白组、高糖组、芍药苷低剂量组、芍药苷中剂量组、芍药苷高剂量组，每天换液。37 ℃和5%CO2培养箱中培养。当细胞生长至50%-70%融合后加入刺激。其中高糖组加入4.25%腹膜透析液，芍药苷低剂量组加入4.25%腹膜透析液及芍药苷50 μg/mL、芍药苷中剂量组加入4.25%腹膜透析液及芍药苷100 μg/mL、芍药苷高剂量组加入4.25%腹膜透析液及芍药苷200 μg/mL。

1.4 Western Blot检测各组蛋白的表达

细胞在同步培养后加入刺激，24h后提取蛋白。使用裂解液裂解蛋白裂解细胞后，采用BCA法测蛋白浓度，依据所测浓度，用细胞裂解液配成统一浓度的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，初始电压为90V，待溴酚蓝至分离胶时加大电压至110V。PVDF膜恒压100 mV转膜。一抗 4 ℃孵育过夜。 洗膜后室温下孵育二抗60 min。 化学发光液 A:B 液按 1∶1 比例混合。洗好的PVDF 膜浸入发光液中 60 s，后置于凝胶成像及化学发光分析系统，选择自动曝光模式连续曝光，选择、保存最佳效果的图像保存。应用计算机成像系统软件对条带进行灰度值定量，以目的蛋白及内参蛋白条带灰度比值表示目的蛋白的相对含量。

1.5 免疫荧光法观察相关蛋白的变化

在24孔板内放置玻片，种细胞，当细胞爬片约50%左右加入刺激剂，24 h后染片。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室温透膜。山羊血清，室温封闭。一抗孵育4 ℃过夜。荧光二抗室温孵育1 h。DAPI染核，避光封片，避光室温风干后 4℃保存。然后在激光共聚焦显微镜观察采集图像。

2 结果

2.1 芍药苷对α-SMA和CTGF蛋白表达的影响

在给予高糖及不同浓度芍药苷刺激后，α-SMA和CTGF表达的蛋白条带如图1所示。将其灰度值与内参蛋白的比值比如图2所示。高糖组的α-SMA的表达高于空白组、芍药苷低剂量组、芍药苷中剂量组和芍药苷高剂量组(P<0.05)。芍药苷高剂量组α-SMA的表达低于芍药苷中剂量组和芍药苷低剂量(P<0.05)。芍药苷高剂量组各组间随浓度增加α-SMA的表达逐渐减少(P<0.05)。高糖组CTGF的表达与空白组、芍药苷高剂量组有显著差异(P<0.05)，与芍药苷中剂量组和芍药苷低剂量无显著差异(P>0.05)。空白组与芍药苷中剂量组和芍药苷低剂量有显著差异(P>0.05)，与芍药苷高剂量组无显著差异(P<0.05)。

2.2 免疫荧光法中α-SMA在各组的表达情况

间接免疫荧光显示空白组α-SMA表达较少，高糖组α-SMA 的表达明显增强，芍药苷组随浓度增加α-SMA的表达逐渐减少。

图1 Western blot(A)；腹膜间皮细胞CTGF(B)和α-SMA(C)的表达

图2 免疫荧光法中α-SMA在各组的表达情况(绿色表示α-SMA，蓝色为细胞核)

3 讨论

腹膜纤维化(PF)在各种临床情况下都是一种严重的并发症，但是驱动其发生的机制尚待完全确定。已知结缔组织生长因子(CTGF)调节成纤维细胞活性，它诱导细胞外基质的产生、新生血管发生，与纤维化发生密切相关。Li及Sakai,N.等的研究表明抑制CTGF的表达后，可进一步抑制成纤维细胞和成肌纤维细胞的积累以及血管新生，从而可以改善腹膜纤维化的进展[3-4]。肌纤维母细胞表面表达平滑肌肌动蛋白α-SMA被公认为腹膜间皮细胞转分化早期的标志因子，在许多研究中作为组织纤维化病变进展指标。

芍药苷是一种糖苷类物质，是白芍根中提取的药效成分单体,是白芍总苷TGP的主要成分。有研究表明芍药苷可以通过Smad依赖性途径抑制肺纤维化中 TGF-β介导的上皮-间质转化[5]，也可以通过TGF-β1/ Smads信号通路对辐射诱导的大鼠肝纤维化有保护作用，抗纤维化的功能越来多的被发现[6]。还有报道显示芍药苷靶向作用于小鼠血吸虫病，改善纤维化。可以因为抗纤维化治疗似乎使肝脏平均肉芽肿直径和纤维化面积明显减少，血清肿瘤坏死因子-α明显增加[7]。我们在早期的研究中发现，TGP对腹膜纤维化大鼠的腹膜通透性有改善，并能一定程度抑制腹膜纤维化的进展[8-9]。因此本研究将使用不同浓度的芍药苷作用于人腹膜间皮细胞，来观察高糖影响下的腹膜间皮细胞的变化。结果表明在一定范围内，随着芍药苷浓度的增加，纤维化的相关指标α-SMA和CTGF均有不同程度下降，提示芍药苷可能通过下调α-SMA和CTGF的表达从而减缓和早期改善腹膜纤维化，进而起到腹膜保护作用。

综上所述，持续的高糖和炎症能促进腹膜分泌TGF-β1，造成腹膜纤维化。芍药苷可减轻其引起的腹膜纤维化，一定程度上保护腹膜。以上研究为芍药苷防治腹膜纤维化提供了的理论依据和方法。