绞股蓝蜜膏对高脂高糖饮食诱导的高脂血症小鼠的影响机制研究

刘新艳,赵浩安,杨二林,程 妮,曹 炜,3

(1.西北大学 食品科学与工程学院,陕西 西安 710069;2.西北大学 化工学院,陕西 西安 710069;3.陕西省蜂产品工程技术研究中心,陕西 西安 710065)

高脂血症是引起各种心血管疾病和代谢紊乱的主要因素[1],极大地威胁着人类的生命健康。据世界卫生组织统计,近15年来,以高脂血症为主的心脑血管疾病是造成人类死亡的头号杀手，2016年全球约有1 520万人死于心脑血管疾病,且预测心血管疾病将继续成为人类死亡的主要原因[2]。高脂血症是由饮食引起的机体胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白水平超出正常范围，而造成的一种全身性脂质代谢异常疾病[3],目前最理想的治疗高脂血症药物价格较为昂贵,且具有一定的副作用[4],因此开发安全且具有降血脂的功能性食品具有重要的意义。已有研究表明,食物中的多酚[5]、多糖[6]、皂苷[7]等均对预防和治疗高脂血症具有一定作用。

绞股蓝作为一种可用于保健食品的天然产物[8],已被证明具有降血脂的作用。绞股蓝系葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物,广泛分布于我国秦岭及长江以南地区[9]。《救荒本草》中记载民间多食用绞股蓝以治疗咳嗽、痰喘、慢性气管炎、传染性肝炎等疾病[10]。现代药理及食品科学理论已证明其具有降血脂[11]、降血糖[12]、神经保护[13]、减肥[14]等诸多功效。研究表明这些功效主要来自于绞股蓝中的皂甙[15]、多酚[16]和多糖[17]等生物活性成分。尤其是其具有和人参皂苷相同的四环三萜达玛烷型结构,因此绞股蓝皂甙一直是绞股蓝的研究热点和评价标准,其中皂苷XLIX和A是目前已知能够定量的绞股蓝皂苷。近年来,有企业将绞股蓝加工为茶便于饮用,但绞股蓝茶味道苦涩,其中的甜味物质较少,游离糖主要以多糖形式存在[18]。因而绞股蓝相关产品还是以中草药和农产品为主,产品形式十分单一,因此，多元化、无苦味的绞股蓝产品开发显得尤为迫切。

蜂蜜作为一种具有药用价值与营养价值的天然食品,不仅在食品配方中充当甜味剂和添加剂,也是降血脂类保健食品的主要原料之一[19]。已有研究表明蜂蜜对血脂异常大鼠具有保护作用[20],将其制备成绞股蓝蜜膏不仅可以起到降脂作用，还可以改善绞股蓝的苦涩味道。因此本研究将绞股蓝水提物与蜂蜜混合制备绞股蓝蜜膏,探究绞股蓝蜜膏对高脂高糖饮食诱导的高脂血症小鼠的影响机制,为丰富蜂蜜和绞股蓝产品形式提供参考,也为功能性食品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绞股蓝全草采自陕西省平利县,中国国家地理标志产品平利绞股蓝。蜂蜜通过陕西省蜂产品工程技术研究中心合作蜂农于2018年收集,经花粉含量分析鉴定为洋槐蜜。洋槐蜜的基本理化指标根据国家标准测得[21]，其中水分(18.3%)、葡萄糖(31.5%)、果糖(39.9%)、蔗糖(1.08%)，电导率为0.22 mS/cm、淀粉酶值为27.1 mL/(g·h)，pH4.0)。人参皂苷XLIX 和人参皂苷A对照品(HPLC级,纯度>98%)购于四川省维克奇股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TECAN Infinite 200 PRO 多功能读板机，帝肯(上海)贸易有限公司;TL16G 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;FD1C50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;722G紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 绞股蓝蜜膏的制备

取绞股蓝药材烘干,粉碎,过60目标准筛。精密称定1 g绞股蓝粉末,置于圆底烧瓶中,加入50 mL 75%的乙醇在80℃下回流提取2次,每次1 h。冷却后离心并合并提取液,将提取液采用冷冻干燥得绞股蓝水提物,与蜂蜜以1∶9配制所得。绞股蓝水提物和绞股蓝蜜膏如图1A所示。

总皂苷含量的测定采用香草醛高氯酸比色法[22],单体皂苷的测定采用高效液相色谱法[23]。测得该绞股蓝水提物中总皂苷含量为30.00 mg/g,单体皂苷XLIX 含量为0.65 mg/g,单体皂苷A含量为0.11 mg/g,色谱图如图1B所示。

图1 绞股蓝蜜膏Fig.1 The paste of Gynostemma and honey(PGH)

1.4 动物实验设计

雄性C57BL/6型小鼠30只,体质量为16～18 g,购于西安交通大学动物实验中心,动物生产许可证号SCXK(陕) 2017-001。小鼠经适应性饲养一周后随机分为3组,每组10只,即正常组、高脂组和绞股蓝蜜膏组。正常组全实验周期给予标准饮食,高脂组和绞股蓝蜜膏组给予高脂饮食诱导小鼠高脂血症。若高脂组小鼠血清TC浓度不低于5.20 mmol/L,TG浓度不低于1.70 mmol/L,且显著高于正常组小鼠,表明高脂血症小鼠造模成功[24]。8周后,给予绞股蓝蜜膏组小鼠灌胃绞股蓝蜜膏10 g/kg小鼠体重 (以总皂苷含量计30 mg/kg),正常组和高脂组小鼠灌胃同等剂量生理盐水,每天一次。第16周结束末次灌胃后,小鼠禁食不禁水12 h并称重,眼眶取血,颈椎脱臼处死小鼠,解剖取出肝脏、肾脏、附睾脂肪等组织待后续分析。

动物饲料由福贝世亨生物医药(上海)有限公司提供。标准饮食组成为9%水、18%～22%蛋白质、4%脂肪、5%纤维、8%灰分和52%～56%无氮浸出物,高脂饲料组成为49.5%标准饮食、20.4%猪油、15%蔗糖、12.3%蛋白质、2%预混料和0.8%麦芽糊精。

1.5 生化指标测定

血清生化指标，小鼠眼眶取血收集于1.5 mL离心管中,3 500 r/min低温离心10 min分离血清测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平。按试剂盒说明进行操作。

肝脏生化指标，取0.2 g肝脏组织于离心管中,按照1∶9(W∶V)加入生理盐水,在冰水浴条件下机械匀浆,将制备好的肝匀浆2 000 r/min低温离心15 min取上清液于离心管中,测定肝脏组织中的TC、TG、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。

生化指标具体操作按照试剂盒说明进行。TC，TG，LDL，AST，ALT，GSH-Px，SOD，MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA法测定IL-6，TNF-α，adipokine，leptin的水平[25]。所有试剂和样品在室温下平衡30 min,分别将样品(50 μL)和抗体(50 μL)加入ELISA孔中,于37℃下孵育30 min。然后丢弃反应溶液,用洗涤液冲洗5次。随后添加显色剂,于37℃下避光15 min进行显色反应。添加终止溶液使反应终止后使用多功能读板器测定吸光度。绘制标准曲线计算样品IL-6，TNF-α，adipokine，leptin水平。

1.7 实时荧光定量PCR测定肝脏组织中炎症因子基因表达

总RNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA提取试剂盒[26],按试剂盒说明操作。取RNA样本,采用PrimeScriptrt RT Master Mix试剂盒反转录合成cDNA。取反转录合成的cDNA样本,根据基因序列特异性设计引物,通过实时荧光定量PCR,采用SYBR GREEN染料法,以β-actin为内参基因作定量检测,并用2-△△Ct法对数据进行分析。

1.8 组织病理学检查

将小鼠肝脏及附睾脂肪用10%中性甲醛溶液固定,经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、组织切片、脱水脱蜡步骤后,经苏木精伊红(H&E)染色,光学显微镜下观察肝脏及脂肪组织。

1.9 数据处理

数据采用Origin 9.0软件作图,SPSS 19.0软件进行数据分析,组间比较采用方差分析和t检验,结果均采用平均值±标准差表示,P<0.05有显著差异,P<0.01有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝蜜膏改善小鼠高脂血症症状

本实验首先测定了小鼠的体重、肝脏指数和空腹血糖(见图2A，2B和2C)。在实验期间,老鼠每两周被称一次体重。在第8周结束时,高脂组小鼠体重达33.94 g,比正常组小鼠增加了31.50%。经过8周绞股蓝蜜膏灌胃后,体重下降了18.23%,比HFD组高19.37%。此外,高脂组小鼠的肝脏指数和空腹血糖也明显高于正常组,与LFD组相比有显著性差异(P<0.05)。绞股蓝蜜膏的摄入完全抑制了肝脏指数和空腹血糖的增加。

由图2D，2E和2F可知,正常组小鼠的各项血液和肝脏指标均处于正常水平。与正常组相比,高脂组的ALT，AST，TC，TG，LDL浓度均显著升高(P<0.05),表明高脂饮食会造成小鼠高脂血症。与高脂组相比,绞股蓝蜜膏组小鼠的血液和肝脏指标均得到改善,ALT，AST，LDL水平均显著下降(P<0.05),其中ALT，AST，TG，LDL均达到正常水平。而由于个体差异,绞股蓝蜜膏组与高脂组小鼠的HDL水平未分析出显著性差异,因此未在图中显示该数据。总体来看,绞股蓝蜜膏改善了小鼠高脂血症的血液和肝脏指标。

A 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠体重；B 肝脏指数；C 血清TC、TG和LDL；D 血清ALT和AST；E 空腹血糖；F 肝脏组织TC和TG注：a,b,c表示差异显著(P<0.05)图2 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠基本生化指标的影响Fig.2 The effect of PGH on biochemical parameters of hyperlipidemic mice

2.2 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠组织病理学的影响

通过小鼠肝脏组织HE染色可以看出(见图3A),正常组小鼠肝细胞以中央静脉为中心,排列比较整齐,肝细胞清晰。细胞核位于细胞中央同时核大而圆,未见脂肪空泡,表明基础饲料对小鼠生长无不良影响。与正常组相比,高脂组小鼠肝细胞排列混乱,细胞核位置杂乱不一,同时肝细胞肿大细胞核被挤到周边,有大量的脂质沉积,肝细胞内充满了大小不等的脂肪滴,形成大量的脂肪空泡。与高脂组比较,绞股蓝蜜膏组小鼠的肝脏病变程度有一定的减轻,肝细胞排列较整齐,基本未出现脂肪空泡。

通过小鼠脂肪组织HE染色可以看出(见图3B),正常组小鼠的脂肪组织细胞大小均匀一致、排列紧密有序、各个细胞轮廓图清晰、脂肪组织细胞较小。与正常组比较,高脂组小鼠脂肪细胞均出现不同程度的增大,且大小不一。与高脂组比较,绞股蓝蜜膏组小鼠的脂肪组织细胞有一定程度的减小,且相对紧密,表明绞股蓝蜜膏对脂肪组织变性有一定的抑制作用。

组织病理学结果与上述生化分析结果一致。表明绞股蓝蜜膏对肝组织和脂肪组织有一定的保护作用,能够改善高脂高糖引起的高脂血症。

A 小鼠肝脏组织HE染色;B 小鼠脂肪组织HE染色图3 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠组织病理学的影响Fig.3 The effect of PGH on pathologic features of hyperlipidemic mice

2.3 绞股蓝蜂蜜对高脂血症小鼠肝脏氧化应激指标的影响

已有研究表明,氧化应激发生在高脂饮食诱导的肥胖和高脂血症小鼠中[27]。我们首先测定了氧化应激相关指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,以评价高脂血症小鼠的氧化损伤。由图4可知,与正常组相比,高脂组小鼠肝脏MDA含量增加60.4%,SOD和GSH-Px活性分别下降22.9%和32.5%。绞股蓝蜜膏的摄入对氧化应激抵抗有明显的改善作用,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)改善率分别为65.2%，97.2%，61.0%。其中MDA含量显著下降(P<0.05),GSH-Px活性显著提高(P<0.05)且与正常组小鼠基本相当。

饲喂高脂饲料导致的肥胖及高脂血症往往伴随着活性氧失调引起的氧化应激[28]。当氧化应激持续很长一段时间时,NO等活性氧增多,攻击细胞膜所形成的过氧化物增多,从而导致脂质过氧化产物MDA含量升高,SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性降低[29]。而食源性皂苷[30]和酚酸[31]的摄入可以提高机体氧化应激防御,本实验表明绞股蓝蜜膏摄入使得高脂小鼠机体的氧化损伤程度减弱,机体抗氧化能力提高。

A 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠SOD;B GSH-Px;C MDA注：a,b,c表示差异显著(P<0.05)图4 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠氧化应激指标的影响Fig.4 The effect of PGH on oxidative stress indexes of hyperlipidemic mice

2.4 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠相关蛋白的影响

高脂饮食导致活性氧的积聚和炎症因子的释放[32]。在测定氧化应激相关指标后,我们对高脂血症小鼠蛋白表达水平进行评估。由图5可知,与正常组相比,高脂组的IL-6，TNF-α，leptin水平显著上升(P<0.05);绞股蓝蜜膏摄入后,显著降低了IL-6，TNF-α，leptin水平(P<0.05)。为进一步评价绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠的影响机制,我们在基因水平上对其进行评估。

A IL-6；B TNF-α；C 脂肪因子；D 瘦素注：a,b,c表示差异显著(P<0.05)图5 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠相关蛋白的影响Fig.5 The effect of PGH on inflammatory factors of hyperlipidemic mice

2.5 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠炎症相关mRNA的影响

当高脂血症小鼠发生时,炎症因子TNF-α，IL-1，IL-6增加,促进了降解细胞内IκB(NF-κB的抑制剂)结合的NF-κB复合物[33-34],从而使得NF-κB从细胞核外转移至核内,调节上述特定炎症因子基因的转录,引发级联反应[35]。因此,本研究测定了小鼠炎症相关mRNA的IκB-α，IL-6，TNF-α，IFN-γ表达。由图6可知,与高脂组相比,绞股蓝蜜膏组小鼠炎症相关mRNA的IL-6，TNF-α，IFN-γ表达明显降低,IκB-α表达明显升高(P<0.05)。这表明,NF-κB信号通路可能是绞股蓝蜜膏治疗高脂血症小鼠的机制之一。

A IL-6；B TNF-α；C IFN-γ；D IκB-α注：a,b,c表示差异显著(P<0.05)图6 绞股蓝蜜膏对高脂血症小鼠炎症相关mRNA的影响Fig.6 The effect of PGH on inflammation-related mRNA of hyperlipidemic mice

3 结论

本实验研究了绞股蓝蜜膏对高脂高糖饮食诱导的高脂血症小鼠的影响机制。结果表明,绞股蓝蜜膏能够改善高脂血症小鼠高脂血症症状,降低肝脏及脂肪组织的组织病理学病变,提高氧化应激防御,改善相关炎症因子和mRNA的表达。因此,本研究表明了绞股蓝蜜膏通过改善氧化应激抵抗和炎症症状来改善高脂高糖饮食诱导的高脂血症,为绞股蓝功能性食品开发提供依据。