益气通络方对糖尿病周围神经病变大鼠HMGB1表达的影响

姜立娟 周晓晶 李欣 李玉国 崔巍 张文风 (长春中医药大学，吉林 长春 130000)

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病最为常见且严重的并发症之一，其起病隐匿，常被忽视〔1〕，临床表现为四肢远端出现对称性感觉和运动神经障碍，并伴有麻木、疼痛、灼热、蚁行感等，严重者可导致糖尿病足部溃疡、感染甚至坏死、瘫痪〔2〕。DPN发病机制异常复杂，至今仍未有完全清晰的阐释，主要涉及糖代谢紊乱、脂代谢异常、炎症反应、氧化应激损伤、糖基化产物蓄积、蛋白激酶C信号通路异常调控等诸多方面，治疗方向主要为控制血糖和改善疼痛〔3〕。DPN是消渴病之变证，可归属于中医学“痹病”“血痹”“络病”等范畴，消渴日久，气阴两虚，脉络瘀阻是其病机关键，治宜益气养阴，活血通络〔4〕。本文通过建立DPN大鼠模型，观察益气通络方对大鼠体重、空腹血糖(FBG)、坐骨神经中高迁移率族蛋白(HMG)B1蛋白及基因表达水平的影响，探讨其对DPN的治疗效果及改善DPN的可能机制。

1 资料与方法

1.1实验动物 70只雄性健康SPF级SD大鼠，平均体重(180±20)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号:SCXK(辽)2015-0001。

1.2主要药物及试剂 益气通络方由黄芪12 g、葛根12 g、生地10 g、当归10 g、桂枝10 g、地龙5 g组成,购自北京同仁堂红旗街店，并经长春中医药大学药学院翁丽丽教授鉴定为正品，符合2015年版《中华药典规范》。格华止盐酸二甲双胍片(购自吉林大药房博硕路店)。链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司，购自北京博爱港股份有限公司，产品批号20190505)。RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)及HMGB1引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，抗大鼠HMGB1单克隆抗体(Abcam公司)。

1.3仪器与设备 血糖仪(三诺生物传感股份有限公司)，台式低温高速离心机(美国Sigma公司)，Medlab生物信号采集处理系统 (南京美易科技有限公司)，全自动酶标仪(BioTek Elx808)，PCR扩增仪〔TC-48/T/H(a),美国〕，荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.4模型建立及分组 将60只SD大鼠，适应性喂养1 w，造模前禁食12 h后，按照55 mg/kg左下腹腔注射1%的STZ溶液，注射30 min后正常喂水喂食，72 h后取尾静脉血检测FBG，若FBG≥16.7 mmol/L即视为造模成功，并取同批次FBG在正常范围(4.7～8.3 mmol/L)的大鼠10只作为正常对照组。造模后，将56只造模成功大鼠随机分为模型对照组、益气通络方高剂量组、益气通络方低剂量组和西药对照组，每组14只。造模成功后即按照人与大鼠体表面积换算法计算给药剂量进行灌胃给药，益气通络方低、高剂量组分别给予益气通络方1.84 g/(kg·d)、7.36 g/(kg·d)，西药对照组给予二甲双胍140 mg/(kg·d)，模型对照组和正常对照组给予等量的0.9% NaCl溶液灌胃，干预12 w，平时注意观察大鼠状态，每周定期检测FBG和体重。电子天平称取大鼠体质量；三诺血糖仪检测大鼠尾静脉血糖。

1.5Medlab生物信号采集处理系统检测各组大鼠坐骨神经传导速度 按照30 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉成功后，取俯卧位固定，用玻璃分针钝性分离大鼠右侧坐骨神经，应用Medlab生物信号采集处理系统对大鼠坐骨神经传导速度进行检测〔5〕。

1.6免疫组化法检测各组DPN大鼠坐骨神经HMGB1蛋白表达水平 将固定于4%多聚甲醛溶液中的各组坐骨神经标本制成石蜡切片并脱蜡至水。微波热修复抗原，为保证染色的特异性，将内源性过氧化物酶灭活，滴加抗大鼠HMGB1单克隆抗体，37℃，2 h，磷酸盐缓冲液(PBS)代替阴性正常组一抗，然后加入辣根酶标记山羊抗鼠IgG多克隆抗体，37℃，30 min，随后二氨基联苯胺(DAB)显色，复染、脱水、透明、中性树胶封片，在高倍镜视野(×400)下每张切片随机选择10个视野，应用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对神经细胞阳性细胞积分光密度值(IOD)进行测定。

1.7RT-PCR法检测各组DPN大鼠坐骨神经中HMGB1 mRNA表达 从液氮中取出保存备用的坐骨神经，应用RNA提取试剂盒提取总RNA。参照试剂盒操作说明，将总RNA逆转录成cDNA。HMGB1上游序列为5′-GCAGCAGTGTTGTTCCACAT-3′，下游序列为5′-CGGCCTTCTTCTTGTTCTGT-3′，内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游序列为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游序列为5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。以cDNA 1 μl为模板扩增HMGB1和GAPDH，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达情况。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1一般情况观察 干预12 w后，与正常对照组相比，其他各组表现出不同程度的多饮、多食、尿量增多及体重下降。模型对照组毛色污秽发黄、缺少光泽，竖毛弓，背腹部膨隆，活动度减小，精神萎靡不振，后肢单侧或双侧偶见痉挛甚至痿废。各治疗组与模型对照组比较病变程度较轻，其中益气通络方高剂量组与西药对照组状态较好。

2.2益气通络方对DPN大鼠体重及FBG的影响 干预12 w后，模型对照组体重较正常对照组显著降低，FBG显著升高(P<0.05)；进行药物干预后，益气通络方高、低剂量组与模型对照组比较，体重显著升高，FBG显著降低(P<0.05)，其中，益气通络方高剂量组体重增长和FBG下降更为显著(P<0.05)。见表1。

2.3益气通络方对DPN大鼠坐骨神经传导速度的影响 给药12 w后，与模型对照组相比，各组坐骨神经运动神经传导速度(MNCV)及感觉神经传导速度(SNCV)显著升高(P<0.05)；益气通络方高剂量组MNCV、SNCV改善显著(P<0.05)。说明益气通络方可显著提高DPN大鼠的坐骨神经传导速度。见表1。

2.4益气通络方对DPN大鼠坐骨神经中HMGB1蛋白和mRNA表达的影响 干预12 w后，模型对照组HMGB1蛋白和mRNA表达显著高于正常对照组(P<0.01)；与模型对照组比较,益气通络方高、低剂量组与西药对照组坐骨神经中的HMGB1蛋白和mRNA表达均显著降低(均P<0.05)。说明益气通络方与西药效果一致，都能使DPN大鼠坐骨神经内HMGB1蛋白和mRNA含量表达降低，但益气通络方高剂量组较低剂量组效果更佳。见表1。

3 讨 论

DPN的发病机制至今尚未阐释清晰。研究发现〔6〕，低水平慢性炎症反应在DPN发生发展中的作用越来越受到人们的关注。HMGB1作为一种重要的晚期致炎因子，几乎表达于所有细胞中〔7〕，由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞释放，其功能是介导炎症反应〔8〕。正常情况下，HMGB1存在于细胞核内，负责参与转录和调控基因〔9〕；当机体缺血、缺氧时，HMGB1通过主动分泌或被动释放两种方式至胞外，发挥炎性介质的作用〔10〕，指导细胞因子、趋化因子、神经免疫或代谢活动等〔11〕。且HMGB1通过识别晚期糖基化终末产物受体(RAGE)和Toll样受体(如TLR2、TLR4)，诱导炎症反应，加速免疫损伤〔12,13〕。此外,HMGB1可调节自噬,增强细胞存活,并限制细胞凋亡〔14〕。HMGB1信号级联还可能触发核因子(NF)-κB途径，进一步激发炎症反应，增加组织损伤。因此，进一步探索HMGB1相关信号通路可能为DPN的治疗提供新的靶点。

益气通络方是张文风教授多年临床治疗糖尿病周围神经病变的经验方，具有益气养阴，活血通络的功效，临床效果显著。方中芪葛同用为君，益气养阴，祛瘀通络；桂枝辛散温通，配伍黄芪，益气温阳，活血通经；生地清热养阴生津，俱为臣药。当归补血活血，与生地相配，养血活血，祛瘀不伤阴，此为佐药。地龙善走力专，通经活络，并引药入络，为佐使药。现代药理学研究发现，黄芪、葛根有效成分都有降血糖、抗炎及保护神经作用〔15〕，黄芪、葛根配伍能够减轻机体的糖脂代谢紊乱和炎症反应，且增加机体对胰岛素的敏感性〔16,17〕。生地具有抗炎、改善血糖及促进血管内皮细胞增殖的作用，环烯醚萜苷是生地的有效成分，对晚期糖基化终末产物(AGEs)引起的糖尿病血管病变具有明显的抑制作用〔18〕。研究证实，当归能对缺氧所致的神经损伤进行保护；并促进血管内皮生长因子激活和神经再生〔19〕；桂枝挥发油具有抑制炎症反应及抗氧化作用，能显著拮抗免疫损伤性炎症〔20〕；地龙中蚓激酶可通过改善血液循环从而减少糖尿病患者周围神经的缺血缺氧性损伤,有效地促进神经修复、再生〔21〕。诸药合用，可发挥改善神经细胞功能、营养周围神经作用，有效改善DPN的神经损伤。

本研究提示益气通络方可以有效降低DPN大鼠FBG，增加体重，改善坐骨神经炎症损伤；可有效下调坐骨神经HMGB1蛋白和mRNA水平，HMGB1可能参与DPN的发病过程，抑制炎症反应，保护坐骨神经免收损伤，对DPN具有很好的治疗效果。