下调miR-199a-5p抑制脂多糖诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系AECⅡ凋亡

王 伟，赵四林，范伏元，金朝晖，李 妲，符 艳

(湖南中医药大学第一附属医院 呼吸内科，湖南 长沙 410007)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pul-monary disease，COPD)简称慢阻肺，是一种常见的慢性呼吸系统疾病，COPD的发病机制除了与炎性反应、氧化与抗氧化失衡等有关外，还与细胞凋亡有关[1]。Ⅱ 型肺泡上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells，AEC Ⅱ )是肺泡上皮细胞的干细胞，AEC Ⅱ 的异常凋亡在COPD发病过程中起重要作用，降低AEC Ⅱ 凋亡可能是治疗COPD的一种途径。研究显示，miR-199a-5p在COPD患者肺组织中表达升高，可能参与COPD的发生发展进程[2]。但miR-199a-5p对型肺泡上皮细胞凋亡的影响还尚不清楚，因此本实验用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导大鼠 Ⅱ 型肺泡上皮细胞凋亡，研究miR-199a-5p对 Ⅱ 型肺泡上皮细胞凋亡的影响及可能机制，以期为COPD的分子治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料:选取2017年4月至2018年12月于湖南中医药大学第一附属医院就诊的45例COPD患者，男性23例，女性22例，年龄47～71岁，平均年龄(60.4±6.8)岁。COPD诊断标准符合2013版《慢性阻塞性肺疾病诊断指南》。排除标准：恶性肿瘤患者；心脏、肾等重要器官功能不全者；急慢性炎性反应疾病患者；自身免疫疾病患者。另选取同时期45名健康体检者，男性21例，女性24例，年龄45～70岁，平均年龄(60.6±6.9)岁。两组患者年龄、性别等一般资料无差异。本研究经医院伦理委员会批准同意(1811017)，患者自愿签署知情同意书。

1.1.2 细胞和试剂:大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系(AECⅡ)(上海柯雷生物科技有限公司)；DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司)；反转录试剂盒和PCR试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol试剂(Invitrogen公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒、膜联蛋白V(annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)； 卷曲受体4(frizzled receptor 4,FZD4)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白 (Bcl-2-associated X protein，Bax)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(北京中杉金桥生物试剂公司)；miR-199a-5p模拟物及模拟对照序列(miR-NC)、miR-199a-5p抑制剂(anti-miR-199a-5p)及抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)、FZD4的小干扰RNA(si-FZD4)及乱序无意义阴性序列(si-NC)(广州锐博生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养与分组：复苏AECⅡ细胞，加入含10% FBS的DMEM培养基中培养，待细胞增殖汇合至80%～90%时，进行消化传代培养。将AECⅡ分为对照组(control)、LPS组(100 ng/mL LPS)、anti-miR-NC组(转染miR-199a-5p抑制剂阴性对照序列)、anti-miR-199a-5p组(转染miR-199a-5p抑制剂)、miR-NC组(转染miR-199a-5p模拟物对照序列)、miR-199a-5p组(转染miR-199a-5p模拟物)、anti-miR-199a-5p+LPS组(转染miR-199a-5p抑制剂后用100 ng/mL LPS培养)、anti-miR-NC+LPS组(转染miR-199a-5p抑制剂阴性对照序列后用100 ng/mL LPS培养)、anti-miR-199a-5p+si-FZD4+LPS组(同时转染miR-199a-5p抑制剂与FZD4小干扰RNA后用100 ng/mL LPS培养)和anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS组(同时转染miR-199a-5p抑制剂与FZD4乱序无意义阴性序列后用100 ng/mL LPS培养)。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-199a-5p和FZD4 mRNA表达：Trizol试剂提取患者血清或细胞中总RNA，定量后按试剂盒说明反转录为cDNA。然后按PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列miR-199a-5p上游5′-GTCGATACCAGTGCGT GTCGTCGTGTCGGC-3′，下游5′-AATTGCACTGGATA CGACAGCCTAT-3′；FZD4上游5′-CCTCGGCTACAAC GTGACC-3′，下游5′-TGCACATTGGCACATAAACAG A-3′；U6上游5′-CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3′，下游5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；GAPDH上游5′-GCCACATCGCTCAGACACC A-3′，下游5′-CT CAGCCTTGACGGTGCCAT-3′。采用2-△△Ct法计算miR-199a-5p相对于U6、FZD4、GAPDH相对表达水平。

1.2.3 流式细胞计量术检测细胞凋亡：各组细胞培养24 h后，PBS清洗2次，用结合缓冲液混悬细胞。依次加入10 μL annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 Western blot检测细胞中FZD4、Bax和Bcl-2蛋白表达：用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量。蛋白样品变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，封闭，加入FZD4(1∶500)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h。加入化学发光试剂，成像后用Image J软件分析目的蛋白条带吸光度值，以GAPDH为内参。

1.2.5 miR-199a-5p与FZD4靶向关系验证：1)Target Scan生物信息学软件预测显示，FZD4的3′UTR与miR-199a-5p的核苷酸序列存在连续结合位点。构建FZD4野生型和突变型双荧光素酶报告质粒(FZD4-WT)和(FZD4-MUT)。分别将miR-199a-5p模拟物与FZD4-WT(miR-199a-5p+ FZD4-WT组)、模拟物对照序列与FZD4-WT(miR-NC+FZD4-WT组)、miR-199a-5p模拟物与FZD4-MUT(miR-199a-5p+FZD4-MUT组)、模拟物对照序列与FZD4-MUT(miR-NC+FZD4-MUT组)共转染至细胞，培养48 h后参照试剂盒说明检测荧光素酶活性。2)anti-miR-199a-5p组、anti-miR-NC组、miR-199a-5p组和miR-NC组细胞分别接种于24孔板中，培养24 h后，Western blot检测FZD4蛋白表达水平，方法同1.2.4。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 COPD患者血清中miR-199a-5p和FZD4 mRNA表达水平

与对照比较，COPD患者血清中miR-199a-5p表达水平升高(1.93±0.13vs1.04±0.09)(P<0.05)，而FZD4 mRNA表达水平降低(0.30±0.05vs1.03±0.09)(P<0.05)。

2.2 LPS对AECⅡ细胞中miR-199a-5p和FZD4表达的影响

与对照组比较，LPS组AECⅡ中miR-199a-5p的表达水平升高(P<0.05)，FZD4 的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)(图1)。

2.3 下调miR-199a-5p对LPS诱导的AECⅡ细胞凋亡及凋亡蛋白表达的影响

与对照组比较，LPS组miR-199a-5p表达水平升高，细胞凋亡率和Bax表达水平显著升高(P<0.05)，而Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。与anti-miR-NC+LPS组和LPS组比较，anti-miR-199a-5p+LPS组miR-199a-5p表达水平降低，细胞凋亡率和Bax表达水平显著降低(P<0.05)，而Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)(图2)。

A.the effect of LPS on the expression of miR-199a-5p in AEC Ⅱ cells; B.the effect of LPS on the expression of FZD4 mRNA in AEC Ⅱ cells; C.the effect of LPS on the expression of miR-199a-5p and FZD4 protein in AEC Ⅱ; *P<0.05 compared with control group

A.the effect of down-regulating miR-199a-5p on apoptosis rate of LPS-induced AECⅡ cells; B.the effect of down-regulating miR-199a-5p on the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in LPS-induced AECⅡ cells; *P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with anti-miR-NC+LPS group；△P<0.05 compared with LPS group

2.4 miR-199a-5p靶向负调控FZD4表达

TargetScan生物信息学软件预测显示，FZD4的3′UTR与miR-199a-5p的核苷酸序列存在结合位点。与miR-NC+FZD4-WT组比较，miR-199a-5p+FZD4-WT组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-199a-5p组FZD4表达显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-199a-5p组FZD4表达显著升高(P<0.05)(图3，4)。

A.the binding site of the 3′UTR of FZD4 and the nucleotide sequence of miR-199a-5p; B.the result of dual luciferase activity detection; *P<0.05 compared with miR-NC+FZD4-WT group图3 miR-199a-5p靶向结合FZD4Fig 3 miR-199a-5p targets binding to FZD4

*P<0.05 compared with anti-miR-NC group; #P<0.05 compared with miR-NC group图4 miR-199a-5p对AEC Ⅱ细胞中FZD4蛋白表达的影响Fig 4 Effect of miR-199a-5p on the protein expression of FZD4 in AEC Ⅱ cells

2.5 下调FZD4表达降低miR-199a-5p对LPS诱导的AECⅡ细胞凋亡的影响

与anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS组比较，anti-miR-199a-5p+si-FZD4+LPS组FZD4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，凋亡率和Bax表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)(图5)。

3 讨论

COPD发生发展过程中，肺泡上皮细胞等肺组织细胞凋亡增加[3]，抑制肺组织细胞凋亡对于COPD的预防和治疗具有重要意义。AECⅡ是肺泡上皮细胞的干细胞，参与肺泡更新和损伤修复，调节肺泡液体量和成分。研究表明，miR-199a-5p参与COPD的发生发展过程。如文献[4]报道称，miR-199a-5p在急性加重期COPD患者血清中表达水平显著高于健康人群，其高表达与GOLD分级、mMRC分级相关。此外，COPD患者肺组织中miR-199a-5p表达水平也升高[5]，且还有研究报道miR-199a-5p可能参与COPD患者机体内Treg细胞调节免疫平衡[6]。本实验结果显示，COPD患者血清中miR-199a-5p表达水平显著升高。此外，本研究还显示，LPS可促进AECⅡ中细胞miR-199a-5p的表达，下调miR-199a-5p表达后，LPS诱导的AEC Ⅱ细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是凋亡相关的重要分子，Bcl-2表达增加可抑制细胞凋亡，而Bax表达增加则促进细胞凋亡。因此，本实验结果提示下调miR-199a-5p表达可有效抑制LPS诱导的AECⅡ细胞凋亡。

生物信息学软件预测显示，FZD4的3′UTR与miR-199a-5p的核苷酸序列存在连续的结合位点，FZD4可能是miR-199a-5p的靶基因。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实了miR-199a-5p可靶向调控FZD4。本实验还发现下调AECⅡ中miR-199a-5p表达后，FZD4蛋白表达升高，而上调miR-199a-5p表达后，FZD4蛋白表达降低，进一步说明miR-199a-5p在AECⅡ中细胞靶向负调控FZD4表达。FZD4是Wnt信号通路上一个7次跨膜受体分子，参与组织损伤修复。研究报道COPD患者肺组织和原代肺泡上皮Ⅱ型细胞中FZD4呈低表达，低表达降低导致肺泡修复能力受损[7]。本实验结果显示，COPD患者血清中FZD4 mRNA表达水平显著降低，与文献报道一致。且LPS诱导的AECⅡ细胞中FZD4的mRNA和蛋白表达降低，提示FZD4参与COPD的发生发展过程。本研究还显示，下调FZD4表达可降低下调miR-199a-5p表达对LPS诱导的AECⅡ细胞凋亡的抑制作用，提示下调miR-199a-5p表达通过上调ZD4表达来抑制LPS诱导的AECⅡ细胞凋亡。

A.the effect of down-regulating FZD4 and miR-199a-5p on apoptosis rate of LPS-induced AECⅡ; B.the effect of down-regulating FZD4 and miR-199a-5p on the expression of apoptosis-related proteins FZD4, Bcl-2 and Bax in LPS-induced AECⅡ; *P<0.05 compared with anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS group

综上所述，下调miR-199a-5p表达可有效抑制LPS诱导的AECⅡ细胞凋亡，其作用机制可能与上调FZD4表达有关，miR-199a-5p/FZD4轴可能为COPD的治疗提供了新靶点。