一例X-连锁无丙种球蛋白血症患者BTK基因新变异体的鉴定

张 晗，孙 阳，王蓉蓉，张 文，张 学*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 麦库西克-张孝骞协和遗传医学中心医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 风湿免疫科国家皮肤与免疫临床医学中心 卫生部重点实验室，北京 100730)

先天性无丙种球蛋白血症(congenital agammaglobulinemia)是一种罕见的原发性免疫缺陷病，其特征是血清免疫球蛋白水平低下和外周血B细胞缺乏。该病常呈X-连锁隐性遗传，但也有常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传形式的报道。其中BTK变异导致的X-连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia, XLA; OMIM 300755)占先天性无丙种球蛋白血症的85%。1952年Bruton最早报道XLA，故又被称为Bruton病[1-2]。美国XLA患者登记的结果显示，该病的最低发病率约为1/37.9万例活产(1/19万例男婴)[3]。中国目前尚无XLA患病率或发病率的准确估计。XLA是由于位于Xq22.1上的Tec家族成员Bruton酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase, BTK)基因发生变异导致的一种原发性体液免疫缺陷病，是典型的原发性B细胞缺陷病[4-6]。BTK基因变异会使得B细胞系发育障碍，血清免疫球蛋白合成不足，最终导致患者感染易感性增加[3, 7-8]。

本研究结合临床表型、全外显子组测序技术(whole exome sequencing, WES)、Sanger测序和实时定量PCR，通过相关基因诊断技术和遗传学分析，对一例XLA患者进行研究，为该病的基因诊断、遗传咨询以及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:男性，31岁，由于3个月内反复发热到北京协和医院风湿免疫科就诊。在获得患者及其家庭成员的知情同意后，收集患者及其家系成员的临床资料、家族史并对患者进行临床诊断及家系分析(图1)。该研究遵循赫尔辛基宣言(Helsinki Declaration)，并获得中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会的审查批准(审批文号：015-2015)。

The square represents male, the circle represents female, the black symbol represents illness, the proband is indicated by an arrow图1 X-连锁无丙种球蛋白血症家系图谱Fig 1 Pedigree diagram of the family with X-linked agammaglobulinemia

1.1.2 试剂:DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)；引物合成(北京天一辉远生物科技有限公司)Trizol试剂盒(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 样本的采集与DNA的提取：留取患者及父母的外周血样本并用全血细胞DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。

1.2.2 WES测序筛选变异：取患者外周血基因组DNA 1 μg送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行WES检测和数据分析，使用HiSeq 2500 PE125测序系统(美国Illumina公司)进行人类全外显子组测序。并按照如下策略进行分析和筛选：1)按照遗传方式关注呈X-连锁遗传和常染色体隐性遗传的变异，不排除新生变异；2)选择最小等位基因频率≤0.001的变异；3)关注位于基因编码区且改变所编码蛋白质的变异及可能改变mRNA剪接的变异，如非同义变异、移码变异和剪接位点变异；4)针对候选基因已报道的基因功能及软件对变异的有害性进行预测，得到候选基因变异体；5)参考2015年美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG) 针对序列变异解读的标准和指南,对所得到变异的有害性进行分类，关注分类为致病、可疑致病和意义不明确的变异。

1.2.3 Sanger测序验证：针对WES筛选出来的变异位点设计引物，从UCSC基因数据库(http://genome.ucsc.edu/)获取基因序列信息，利用Primer3 Input(version 4.1.0)(http://primer3.ut.ee/)进行在线设计引物，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。PCR扩增患者及父母DNA样本后，扩增产物送北京诺赛基因公司进行测序。

1.2.4 RNA的提取及cDNA测序：用Trizol试剂盒提取患者及其父亲外周血中总RNA，使用反转录试剂盒反转录2 μg RNA获得cDNA。PCR扩增患者及其父亲cDNA样本后，扩增产物送北京诺赛基因公司进行测序。

1.2.5 实时定量PCR检测mRNA：以β-Actin为内参，使用荧光定量PCR仪(QuantStudio®3 Real-Time PCR Instrument)检测BTKmRNA的相对表达量。数据采用2-△△Ct法分析，具体方法为：△Ct=目标基因Ct均值-内参基因Ct均值，△△Ct=患者△Ct-健康对照△Ct。实时定量PCR实验重复3次。

2 结果

2.1 临床信息

患者(图1)男性，31岁，因反复发热、咳嗽就诊。自诉自幼经常发热，并伴有反复的上呼吸道感染及肺部感染，咳嗽、咳痰，否认痰中带血。既往患有慢性支气管炎。患者因无明显诱因下经常出现腹痛、水样便腹泻被诊断为“慢性结肠炎”，否认便血。偶发双膝关节疼痛。患者生长曲线正常。患者父母否认近亲婚配史，患者否认其男性亲属有类似疾病。母亲妊娠期间无异常。

2.2 实验室检查

患者血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG显著降低，IgE大致正常。患者外周血淋巴细胞亚群分析显示，外周血B淋巴细胞(CD19+)百分比为0，显著降低。自然杀伤细胞(CD16+CD56+)百分比轻微降低，外周血T细胞(CD3+、CD4+、 CD8+、CD4+/ CD8+)正常。

2.3 WES测序结果分析和Sanger测序验证

通过WES测序，总共得到10 G的数据量，平均深度>100*。通过上述分析流程，鉴定出患者在BTK(NM_000061)的3号内含子c.240+3A>C处有一变异，Sanger测序发现该变异来源于其母亲，符合家系基因型-表型共分离(图2)。该变异在dbSNP153数据库、ExAC数据库、gnomAD数据库以及人类基因突变数据库 (Human Gene Mutation Database, HGMD)中均未见报道。

图2 患者及其父母BTK变异位点测序图Fig 2 Sanger sequence chromatograms of the BTK variant in the patient and his parents

2.4 cDNA测序和mRNA定量检测

cDNA测序显示c.240+3A>C变异BTK3号内含子5′端106 bp碱基插入到BTK转录本第3号和第4号外显子之间，引起阅读框改变，终止密码子提前出现(图3)。实时定量PCR显示，与无血缘关系正常男性(control)及其父亲(Ⅰ-1)相比，患者(Ⅱ-1)BTK的mRNA表达水平明显降低(图4)。

3 讨论

先天性无丙种球蛋白血症是一种由于B细胞早期发育障碍所致的原发性免疫缺陷病，包括X-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传。其中，XLA是一种由于B细胞早期发育障碍所致的原发性免疫缺陷病，呈X-连锁隐性遗传。患者多于6到12个月龄时起病，其最突出的临床特征为早发、 反复的严重细菌感染[9]。XLA感染部位主要包括呼吸系统和消化系统，另外，还容易出现中耳炎、慢性鼻窦炎、皮肌炎等并发症[6]。因该患者有反复的感染史，实验室检查结果显示血清免疫球蛋白减少，外周血成熟B淋巴细胞缺如，怀疑其患有先天性无丙种球蛋白血症，因此需对患者进行基因检测辅助临床诊断。

A.sanger sequence chromatograms of the BTK cDNA; B.schernatyc presentation dragram of BTK cDNA

The values presented are means of triplicate determinations，the control was set to 1.0，the Y-axis represented the relative expression of BTK, the results of the experiment were repeated three times图4 患者及患者父亲BTK相对表达量Fig 4 Relative mRNA expression of the BTK in the patient and his

BTK变异分析是XLA的诊断依据。BTK基因位于Xq22.1，长度为37 kb，包含有19个外显子。该基因编码的细胞质酪氨酸激酶蛋白(BTK)含有5个功能结构域，分别为PH、TH、SH2、SH3和TK[10-11]，已报道的变异主要包括错义变异、无义变异、插入或缺失变异和剪接变异等，暂未发现突变热点区域。其分子缺陷会导致B细胞系列发育障碍和功能障碍，从而导致免疫球蛋白缺乏和特异性抗体产生障碍[11-12]。本研究中患者携带c.240+3A>C变异，HGMD中未见报道，该突变导致来自3号内含子5′端的106 bp碱基插入到BTK转录本3号外显子和4号外显子之间，提前出现终止密码子，mRNA发生降解，最终导致患者XLA疾病的发生。

BTK变异体检测有助于XLA 早期诊断。全外显子组测序技术的快速发展和广泛应用，有助于BTK变异的鉴定。XLA如果不正规治疗将会导致该病发病率和病死率激增[3]。早期诊断并给予有效治疗有助于减少患者反复的细菌感染，避免严重并发症的发生，改善患者的生存质量。自1952年Bruton成功地使用替代免疫球蛋白疗法治疗了第一例患者以来，免疫球蛋白替代疗法一直是XLA的主要治疗方法，目前有静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIG)途径和皮下注射免疫球蛋白(subcutaneous immunoglobulin, SCIg)途径两种[1, 13-14]。

综上所述，本研究结合患者临床表型、实验室检查结果以及患者遗传学检测结果，鉴定了一个XLA的致病基因变异，为该患者的基因诊断、遗传咨询以及治疗提供了依据;发现了BTKc.240+3A>C这一新的变异位点，丰富了BTK基因变异数据库。