低频超声微泡增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞自噬的作用及机制

李颖 董明华 张萌萌 孟芳 杨晓慧

三阴性乳腺癌是对人表皮生长因子受体2为靶点的靶向治疗及雌激素受体、孕激素受体为受体的内分泌治疗一般无效的特殊乳腺癌类型，进展快，预后差[1]。目前，化疗是三阴乳腺癌治疗的常规手段，紫杉醇是治疗三阴乳腺癌的常规化疗药物之一[2]。但是化疗药物渗透性差，难以顺利通过细胞膜，无法有效杀伤细胞。低频超声可通过空化效应改变细胞膜通透性，增强化疗药物杀伤力，超声微泡可以增强低频超声的空化效应[3-4]。自噬是细胞降解或清除损伤细胞器并将代谢产物再利用的过程，适当的自噬可保护细胞自身，但剧烈的自噬反应反而加速细胞凋亡。紫杉醇可诱导三阴性乳腺癌细胞发生自噬，导致癌细胞产生紫杉醇耐药[5]。本研究观察低频超声微泡技术对紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞自噬的影响。

材料与方法

一、试剂与仪器

人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468(货号：YS-2032X)购自美国sciencell公司。

二、方法

1.细胞培养：将三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞接种于DMEM培养基(德国merck/sigma)，置于37 ℃、5% CO2培养箱(日本松下)中培养，传代后取对数期细胞进行实验。

2.MTT法检测MDA-MB-468细胞增殖：取MDA-MB-468细胞以1×105个/ml、每孔100 μl接种于96孔培养板。按以下进行分组：分组①加0、1、3、6、12、24 μg/ml紫杉醇，0 μg/ml紫杉醇为对照；分组②对照组(不进行紫杉醇及低频超声微泡处理)、紫杉醇组(6 μg/ml紫杉醇)、低频超声组(声强0.5 W/cm2、频率1 MHz、辐照时间30秒+6 μg/ml紫杉醇)和低频超声微泡组(声强0.5 W/cm2、频率1 MHz、辐照时间30秒+6 μg/ml紫杉醇+5%微泡)。培养48小时，每孔加MTT溶液(美国AMEKO)20 μl，培养4小时，弃上清液，每孔加二甲基亚砜溶液150 μl，振荡10分钟，酶标仪(美国BioTek)测定各孔吸光度(optical density，OD)值，计算增殖抑制率，增殖抑制率=(OD对照孔-OD实验孔)/OD对照孔×100%。

3.流式细胞仪检测MDA-MB-468细胞凋亡：按分组②处理，培养48小时，收集细胞，重悬为1×106个/ml，加入Annexin V-FITC/PI染液(哈尔滨新海基因检测有限公司)5 μl，混匀、避光孵育20分钟，流式细胞仪(美国Millipor)检测细胞凋亡。

4.MDC染色检测MDA-MB-468细胞自噬：按分组②处理，培养48小时，弃培养液，每孔加MDC染液(上海西格生物科技有限公司)10 μl，37 ℃孵育30分钟，用1×Washbuffer漂洗后重悬，取细胞悬液滴片，荧光显微镜(日本Olympus)检测并拍照。

5.蛋白免疫印迹法检测各组MDA-MB-468细胞中凋亡及自噬相关蛋白表达情况：按分组②处理，培养48小时，收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA测定蛋白浓度。电泳、转膜，脱脂奶粉封闭1小时，加入Bcl-2抗体、Bax抗体、Beclin1抗体、LC3抗体、GAPDH抗体(1∶500，美国abcam)，4 ℃孵育过夜，加羊抗兔二抗(1∶5 000，美国santa)，室温孵育1小时，发光显色，拍摄图像，分析条带灰度。

三、统计学分析

结果

1.不同浓度紫杉醇对MDA-MB-468细胞增殖的影响：1、3、6、12、24 μg/ml紫杉醇处理下MDA-MB-468细胞增殖抑制率分别为(12.03±3.36)%、(25.37±4.85)%、(39.14±4.67)%、(51.85±4.23)%、(60.04±4.82)%，与0 μg/ml相比明显升高(P<0.05)。

2.各组MDA-MB-468细胞增殖情况：与对照组相比，紫杉醇组MDA-MB-468细胞增殖抑制率(38.77±4.82)%显著升高(P<0.05)；与紫杉醇组相比，低频超声组MDA-MB-468细胞增殖抑制率(49.86±4.65)%显著升高(P<0.05)；与低频超声组相比，低频超声微泡组MDA-MB-468细胞增殖抑制率(57.34±4.22)%显著升高(P<0.05)。

3.各组MDA-MB-468细胞凋亡情况：与对照组(5.66±0.85)%相比，紫杉醇组MDA-MB-468细胞凋亡率(22.85±2.96)%显著升高(P<0.05)；与紫杉醇组相比，低频超声组MDA-MB-468细胞凋亡率(39.74±3.68)%显著升高(P<0.05)；与低频超声组相比，低频超声微泡组MDA-MB-468细胞凋亡率(46.58±3.56)%显著升高(P<0.05)。见图1。

4.各组MDA-MB-468细胞MDC染色情况：MDC染色结果显示，自噬体呈绿色点状结构，与对照组相比，紫杉醇组MDA-MB-468细胞中绿色点状物明显增多；与紫杉醇组相比，低频超声组MDA-MB-468细胞中绿色点状物明显增多；与低频超声组相比，低频超声微泡组MDA-MB-468细胞中绿色点状物明显增多。见图2。

图1 各组MDA-MB-468细胞凋亡情况

图2 各组MDA-MB-468细胞MDC染色情况(×400)

5.各组MDA-MB-468细胞中凋亡及自噬相关蛋白表达情况：与对照组相比，紫杉醇组MDA-MB-468细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平显著升高，Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与紫杉醇组相比，低频超声组MDA-MB-468细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平显著升高，Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与低频超声组相比，低频超声微泡组MDA-MB-468细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平显著升高，LC3Ⅰ蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图3、表1。

表1 各组MDA-MB-468细胞中Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达水平比较

图3 各组MDA-MB-468细胞中Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达情况

讨论

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，近年来其发病率不断升高，其致死率位居女性恶性肿瘤首位，严重影响女性生命健康[6]。我国每年乳腺癌发病例数约有16.9万，占全球乳腺癌总发病例数的12.25%[7]。三阴性乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌，约占乳腺癌的10%～20%，与其它类型的乳腺癌相比，其因缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达，治疗手段十分受限，复发性更强，临床预后较差。化疗是三阴性乳腺癌的主要治疗手段之一，紫杉类、蒽环类药物是三阴性乳腺癌化疗的首选药物。但是，用药后细胞对药物敏感性低在一定程度上限制了药物的临床应用[8]。

近年来，超声联合微泡造影剂常用于辅助肿瘤化疗、靶向治疗。研究表明，低频超声可以有效杀伤肿瘤细胞，破坏并抑制肿瘤组织增殖，在肿瘤治疗方面已显示出较好的应用前景，具有穿透力强、组织衰减低及对正常细胞损伤小、对恶性肿瘤细胞敏感等特点，这既是低频超声用于治疗肿瘤的优越性，同时也是其安全性的理论基础。微泡造影剂是一种直径1～8 μm、内含高密度惰性气体、外有单层膜包裹的微气泡，对声压具有较好的抵抗力。在低频超声的作用下，微泡造影剂发生不对称的压缩、膨胀，微泡震荡频率达到一定程度发生破裂，释放出化疗药物，被称为空化效应[9]。超声联合微泡不仅能够通过引起微声流黏滞应力，导致细胞骨架损伤及DNA链断裂，还能够增强细胞膜的通透性，有助于药物通过细胞膜上的穿孔运输至胞内发挥作用。本研究通过紫杉醇浓度梯度对MDA-MB-468细胞增殖影响实验，最终选择6 μg/ml为紫杉醇处理浓度。使用紫杉醇处理MDA-MB-468细胞后，MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高，细胞中代表自噬体的绿色点状物也明显增多，表明紫杉醇不仅能抑制MDA-MB-468细胞增殖并引起细胞凋亡，还能引起细胞自噬。

自噬是细胞通过清除损坏的细胞器、多余的蛋白质并再利用的过程，是细胞的一种自我保护机制，但在肿瘤治疗中是一把“双刃剑”。有研究发现，自噬是肿瘤细胞发生化疗耐药的原因之一，如自噬可以通过胃癌中的AMPK/ATG5途径促进Metadherin诱导的化疗耐药性[10]。而采取措施抑制细胞自噬可增加细胞的药物敏感性，减少耐药发生，如二氯乙酸盐可通过抑制非小细胞肺癌的自噬增强化学治疗剂的抗肿瘤功效[11]。而有研究发现，过度的自噬会引起细胞的自噬性死亡，有助于化疗药物杀伤癌细胞，如α-倒捻子素可能主要通过诱导自噬性死亡而影响人胃癌细胞的活力[12]。高久蕉等[13]研究表明，LFS-01可通过阻断CRM1运载蛋白出核、抑制STAT3信号通路的激活，从而促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231发生自噬、细胞周期阻滞和凋亡。吕雨晨等[14]研究表明，地高辛能够调节凋亡蛋白的改变，损伤线粒体膜电位，抑制癌细胞的活力，促进其凋亡，并诱导自噬的发生，从而发挥抗肿瘤的作用。本研究结果显示，与紫杉醇组相比，低频超声组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高，自噬体绿色点状物明显增多；与低频超声组相比，低频超声微泡组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高，自噬体绿色点状物明显增多，提示低频超声可增强紫杉醇诱导MDA-MB-468细胞的增殖抑制、凋亡、自噬反应，且在此基础上使用微泡可进一步增强这些作用。Bcl-2、Bax是凋亡家族Bcl-2蛋白家族成员，分别在细胞凋亡过程中抗凋亡与促凋亡作用[15]。Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ均为自噬相关蛋白，其中，Beclin1在自噬起始起关键调控作用，LC3Ⅰ在自噬过程中逐渐向LC3Ⅱ转化[5,15]。本研究结果显示，随着紫杉醇、低频超声、微泡逐步处理，MDA-MB-468细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平依次显著升高，Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平依次显著降低，这进一步证实了低频超声微泡对紫杉醇诱导MDA-MB-468细胞凋亡、自噬的增强作用。

综上所述，低频超声微泡能够提高MDA-MB-468细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白水平，降低Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白水平，增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖抑制、凋亡、自噬作用，在临床上增强化疗敏感性或减少化疗抵抗方面具有良好前景。