酱油曲中谷氨酰胺酶酶学特性研究

孙启星，曾小波，李学伟，朱新贵

(李锦记(新会)食品有限公司，广东 江门 529100)

酱油中的鲜味成分主要来源于大豆蛋白经微生物酶解之后形成的氨基酸、多肽类物质，而呈鲜味的氨基酸主要是谷氨酸。大豆蛋白中含有约16%谷氨酸，其中约46%谷氨酸以谷氨酰胺的形式存在[1]。谷氨酰胺不具有鲜味，其在谷氨酰胺酶的作用下可转化为谷氨酸和氨[2-3]，因此研究谷氨酰胺酶提高酱油的鲜味具有重要意义。

米曲霉产谷氨酰胺酶方面的研究已有较多报道，周其洋等[4]通过ARTP诱变技术使米曲霉产谷氨酰胺酶活力提高25%；马永强等[5]通过优化制曲工艺，使曲料中谷氨酰胺酶酶活力达到2.2 U/g；邹敏娟[6]利用谷氨酸快速检测试剂盒建立了曲料中谷氨酰胺酶检测方法。关于其他微生物产谷氨酰胺酶酶学性质分析也有较多研究，如解淀粉芽孢杆菌[7]、枯草芽孢杆菌等[8]，而关于米曲霉的研究较少。

本文以酱油曲中谷氨酰胺酶为研究对象，通过研究不同的温度、pH、NaCl和底物对谷氨酰胺酶酶活力的影响，分析其酶学特性，为提高酱油中谷氨酸含量提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

种曲：李锦记(新会)食品有限公司自制；黄豆、面粉：均为市购。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、氧化镁、氯化钠、谷氨酸钠、氢氧化钠、盐酸、乙酸：均为分析纯，广州化学试剂厂；L-谷氨酰胺、天冬酰胺：色谱纯。

BBI Life Sciences AL204型分析天平、FE28台式pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；磁力搅拌水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司；Kjeltec KT200福斯全自动定氮仪 福斯分析仪器公司；MGC-400H人工气候培养箱、HWS-26恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌器 日本ALP株式会社；冰箱 海尔集团；电位滴定仪 瑞士万通(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 成曲制备

黄豆加水浸泡3 h后，在121 ℃下蒸煮20 min，冷却降温至30～35 ℃，与面粉混合拌料，黄豆和面粉的比例为7∶3，同时接入3‰种曲，混合均匀后在30 ℃，湿度96%条件下培养，在培养时间17，25 h进行松曲，48 h出曲，即为酱油成曲。

1.2.2 温度对谷氨酰胺酶活力的影响

温度对酶活力的影响：曲料用不同温度的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)打浆后，分别在相对应温度30，40，50，55，60，65 ℃条件下检测谷氨酰胺酶酶活。

谷氨酰胺酶热稳定性：曲料用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)打浆后，分别置于30，40，55，65 ℃水浴锅中保温，每隔2 h取样检测谷氨酰胺酶酶活。

1.2.3 pH对谷氨酰胺酶活力的影响

pH对酶活力的影响：采用不同pH值(4，5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9)缓冲液打浆后，在37 ℃条件下检测谷氨酰胺酶酶活。

谷氨酰胺酶pH稳定性：将不同pH值(6，7，8，9)的缓冲液预冷至4 ℃，分别与曲料打浆后，放置在4 ℃冰箱中，每隔3 h取样检测谷氨酰胺酶酶活。

1.2.4 NaCl对谷氨酰胺酶活力的影响

NaCl对酶活力的影响：用pH 7.2磷酸盐缓冲液配制不同浓度的食盐水2%、6%、10%、15%、18%，与曲料打浆后，在37 ℃条件下检测谷氨酰胺酶酶活。

谷氨酰胺酶NaCl稳定性：用pH 7.2磷酸盐缓冲液配制不同浓度的食盐水0%、2%、6%、10%，预冷却至4 ℃，分别与曲料打浆后，放置于4 ℃冰箱中，每隔1 h取样检测谷氨酰胺酶酶活。

1.2.5 谷氨酰胺酶底物专一性和底物抑制作用

底物专一性：用天冬酰胺代替谷氨酰胺，其他同1.3酶活力检测方法。

底物抑制作用：用pH 7.2磷酸盐缓冲液配制不同浓度的味精20，60，100 g/L，与曲料打浆后，在37 ℃条件下检测谷氨酰胺酶酶活。

1.3 酶活力检测方法

10 g曲料加40 g磷酸盐缓冲液(pH 7.2)后打浆粉碎，取浆液35 g，加入0.5 g谷氨酰胺，37 ℃磁力搅拌反应1 h，反应结束后立即添加3 g TCA溶液(20%)终止反应，空白先添加TCA溶液后再添加谷氨酰胺反应；取10 g反应液检测氨含量[9]，氨的检测方法参照GB 5009.234-2016。

谷氨酰胺酶活力定义：在37 ℃、pH 7.2的反应条件下，每1 min水解谷氨酰胺产生1 μmol NH3定义为1个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 温度对谷氨酰胺酶酶活力及稳定性的影响

根据1.3酶活力检测方法，在不同温度反应体系中保温1 h检测酶活力，结果见图1。

图1 温度对谷氨酰胺酶活力的影响Fig.1 Effect of temperature on the activity of glutaminase

由图1可知，随着反应温度的升高，酶活力呈线性上升，在55 ℃达到最高酶活力4.4 U，这与梁天一等[10]从枯草芽孢杆菌中分离的谷氨酰胺酶的最适反应温度一致，但是与邹敏娟等研究表明酱油曲中最适反应温度37 ℃不同，可能是曲霉所产谷氨酰胺酶结构不同导致的。当温度大于55 ℃时，酶活力快速下降，温度对酶活力的影响较大。

温度除了影响酶活力外，对酶的稳定性也有较大的影响，不同温度对谷氨酰胺酶热稳定性的影响见图2。

图2 谷氨酰胺酶热稳定性Fig.2 Effect of temperature on the stability of glutaminase

由图2可知，在同一温度条件下，随着时间的延长，酶活力逐渐下降，温度越高酶活力下降越快。55 ℃条件下维持8 h后，酶活力仅为初始酶活的30%，酶活损失严重。因此，谷氨酰胺酶酶解过程中应同时考虑温度对酶活力和热稳定性的影响，提高底物的转化率。

2.2 pH对谷氨酰胺酶酶活力及稳定性的影响

反应体系过酸或过碱均会影响蛋白酶结构，进而降低蛋白酶的活性。本文分析了不同pH值对谷氨酰胺酶活力的影响，见图3。

图3 pH对谷氨酰胺酶活力的影响Fig.3 Effect of pH on the activity of glutaminase

由图3可知，最适反应pH值在7.0～7.5之间，超过此范围，酶活急剧下降，直至失活。目前已有报道的产谷氨酰胺酶微生物中，解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉所产谷氨酰胺酶最适pH在7.0左右，而柠檬酸细菌和酵母菌属产谷氨酰胺酶最适pH偏酸性，这与微生物本身的特性有关。

通过不同pH值缓冲液维持相应pH，将其放置在4 ℃条件下，间断取样检测酶活，分析谷氨酰胺酶在不同pH条件下的稳定性，结果见图4。

图4 谷氨酰胺酶pH稳定性Fig.4 Effect of pH on the stability of glutaminase

不同的pH条件下，酶活的下降趋势基本一致，即不同pH条件对酶活稳定性无明显差异，该现象优于温度对酶活稳定性的影响。米曲霉产谷氨酰胺酶在pH 6.0～9.0范围内均能保持较高活性，这与解淀粉芽孢杆菌产谷氨酰胺酶pH稳定性一致，比酵母产谷氨酰胺酶范围更广泛，酵母产谷氨酰胺酶在酸性条件下较稳定，当pH高于4.5时，酶稳定性开始快速下降[11]。

2.3 NaCl对谷氨酰胺酶酶活力及稳定性的影响

酱油酿造常分为高盐稀态和低盐固态两种发酵工艺，均为高盐环境，即使是低盐固态发酵，其NaCl含量也在10%以上，因此谷氨酰胺酶必须具有一定的耐盐性，才能发挥其活力。不同浓度NaCl下谷氨酰胺酶酶活力的变化趋势见图5。

图5 NaCl对谷氨酰胺酶活力的影响Fig.5 Effect of NaCl on the activity of glutaminase

由图5可知，随着NaCl浓度的提高，酶活力急剧下降，在15% NaCl浓度下，酶活力基本为0；在6% NaCl条件下，酶活力损失70%以上；在10% NaCl力的条件下，酶活力仅剩余约15%，NaCl对谷氨酰胺酶活性影响显著。卢慧茵等对解淀粉芽孢杆菌产谷氨酰胺酶耐盐性研究表明，在15% NaCl浓度时仍能保持70%以上相对酶活，这可能与不同微生物所产谷氨酰胺酶的结构有关。Yoshimune等研究证明，当NaCl的浓度超过1.7 mol/L时，谷氨酰胺酶C端片段会发生构型变化，从而使谷氨酰胺酶具有一定的耐盐性[12-13]。

图6 谷氨酰胺酶NaCl稳定性Fig.6 Effect of NaCl on the stability of glutaminase

对不同NaCl浓度条件下的酶活稳定性进行分析(见图6)，NaCl的浓度越高，酶失活的速度越快。在6% NaCl体系中维持4 h，酶活力全部失活，而在10% NaCl体系中仅能存放2.5 h。即使在较低NaCl条件下(2%)，维持5 h后，蛋白酶失活70%以上，并且随着时间的延长继续降低，这表明米曲霉产谷氨酰胺酶几乎不耐盐。

2.4 谷氨酰胺酶底物专一性及底物抑制作用

呈鲜味的氨基酸主要为谷氨酸和天冬氨酸，这两种氨基酸都能以酰胺形式存在，必须脱酰胺后才能呈现出鲜味，因此本文分析了谷氨酰胺酶对天冬酰胺的作用。

表1 谷氨酰胺酶底物专一性及底物抑制性Table 1 The specificity and inhibition ability of glutaminase substrate

由表1可知，谷氨酰胺酶对天冬酰胺也有活性，其酶活为谷氨酰胺底物的50%，这说明谷氨酰胺酶为非专一性蛋白酶，这与韩铭海等[14]的研究结果一致。

谷氨酸浓度对谷氨酰胺酶的抑制作用也是限制体系谷氨酸含量提高的影响因素。不同浓度谷氨酸条件下谷氨酰胺酶活力见表1，结果表明，在100 g/L谷氨酸条件下，酶活力无抑制作用，即在一定浓度条件下，谷氨酰胺酶无产物抑制作用。

3 结论

本文从温度、pH、盐含量、底物专一性和底物抑制作用5个因素出发，深入分析了酱油曲中谷氨酰胺酶酶活特性，研究结果表明，米曲霉产谷氨酰胺酶最适温度为55 ℃，热稳定性较差，在最适温度下维持8 h，酶活力损失70%以上，并且随着时间的延长继续下降；最适pH为7.0，在pH 6.0～9.0范围内均能维持较高的活性，酶活力下降速度较慢；谷氨酰胺酶耐盐性较差，在6% NaCl条件下，酶活力失活70%以上，在15% NaCl时，酶活力几乎为0；在耐盐性方面，在6% NaCl体系中维持4 h，酶活力全部失活，即使在2% NaCl条件下维持5 h后，酶活力损失70%以上，并随着时间的延长继续降低，这说明米曲霉产谷氨酰胺酶几乎没有耐盐性，通过提高米曲霉谷氨酰胺酶活力提升谷氨酸含量的方案从理论上是不可行的。谷氨酰胺的脱酰胺过程，可以通过额外添加耐盐性谷氨酰胺酶或者在发酵过程中添加能够合成耐盐性谷氨酰胺酶的微生物实现。研究结果还表明，谷氨酰胺酶也可以将天冬酰胺转化为天冬氨酸，其转化效率仅为谷氨酰胺的一半，并且高浓度谷氨酸对谷氨酰胺酶无底物抑制作用。本研究结果旨在为酱油中谷氨酸含量的提升提供一定的理论指导。