基于pH调节的CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的构筑与性能研究

刘瑞雪，李迎博，陈纪超

郑州轻工业大学 材料与化学工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

羧甲基壳聚糖(CMCS)是壳聚糖经羧基化后形成的一种多糖[1-2]，侧链上易电离的羧基增大了其在水中的溶解能力，且在溶解过程中不受pH值的限制.这既保留了CMCS自身良好的生物相容性，也增加了其溶解性，在高pH值条件下自身不会发生凝胶化反应，因此被广泛应用于生物医学、生物技术等领域[3-4].

天然高分子魔芋葡甘聚糖[5]、明胶[6]、壳聚糖(如CMCS)等常被用作基础原料合成水凝胶.传统的CMCS水凝胶通常采用戊二醛进行交联反应制得[7-8]，如E.Y.Yan等[9]以戊二醛为交联剂，制备了一种具有有效孔洞结构的CMCS水凝胶.但由于戊二醛具有一定的毒性，且该类水凝胶强度较小，这在一定程度上限制了CMCS水凝胶的应用.采用生物毒性较小的交联剂制备水凝胶成为近年来的研究趋势.朱寿进等[10]采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)交联体系，制备了一种羧甲基壳聚糖自交联水凝胶;刘水莲等[11]通过调节 EDC/NHS用量,制备了不同交联度的CMCS水凝胶.上述文献都仅研究了该类水凝胶的溶胀、生物降解、药物缓释等性能，而未对其力学性能、导电性能等进行分析研究.

聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸/二氧化硅(Poly(MMA/MAA)/SiO2,PMMS)乳胶粒，是一种表面负载纳米SiO2的碱溶胀型阴离子乳胶粒子微球.该乳胶粒可以在碱性条件下发生体积溶胀，在pH值大于pKa(乳胶粒中含有羧基基团，其电离平衡常数pKa为7.5[12])的条件下会发生溶胀，形成物理凝胶.在更高的pH值条件下，PMMS乳胶粒的高分子链会解缠结，形成舒展的聚合物链[12-14]，具有一定的pH调节性.基于此，本文拟以PMMS、CMCS、丙烯酰胺(AAm)为原料， EDC/NHS为催化剂，采用pH调节，通过自由基聚合反应制备CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶，并研究其流变性能、力学性能、溶胀性能、电导性能及生物相容性，以期为该类复合水凝胶在组织工程、伤口敷料、柔性电极等生物医学和生物技术领域的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：CMCS、AAm，上海麦克林公司生化科技有限公司产；MMA、MAA、NHS、EDC、过硫酸铵(APS)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，阿拉丁试剂上海股份有限公司产；NaOH， 天津市风船化学试剂科技有限公司产.以上试剂均为分析纯.SiO2溶胶(Bindzil CC301)，阿克苏诺贝尔公司产；PMMS乳胶粒,郑州轻工业大学实验室自制；抗凝兔血，广州鸿泉生物科技有限公司产.

主要仪器：DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产；RTS-9型双电测四探针测试仪、AK-1140 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产；DZF-6030型真空干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司产； HAKE MARSIII型哈克流变仪，美国Themo Fisher公司产；HY型微机控制万能材料试验机，深圳三思纵横科技股份有限公司产；JSM-7001E型扫描电子显微镜，日本JEOL公司产；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司产；EFZ UV-4802H型紫外可见分光光度计，尤尼科(上海)仪器有限公司产.

1.2 PMMS乳胶粒的制备

参照课题组前期的合成方法[15-16]，以SiO2溶胶为稳定剂、MMA和MAA为共聚单体，通过Pickering乳液聚合的方法制备得到PMMS乳胶粒.

1.3 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的制备

称取一定量质量分数为23%的PMMS乳胶粒，加水稀释，搅拌均匀，使用注射器滴加微量质量分数为32%的NaOH溶液，调节溶液的pH值；然后，加入一定量质量分数为15%的CMCS溶液，再加入少量的EDC和NHS，搅拌30 min；最后依次加入一定量的AAm、MBA、APS，搅拌均匀，60 ℃下反应5 h，即可制得pH 值分别为6、7、9、10的CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶.

1.4 表征和测试方法

内部结构表征：将复合水凝胶快速冷冻后，置于加热型冷冻干燥机中真空干燥至恒重，切片，喷金，使用扫描电子显微镜，在25 kV的加速电压下观察其内部结构.

流变性能测试：测试仪器为哈克流变仪；样品规格为圆片状，直径为20 mm，高为4 mm；测试温度为25 ℃；应变扫描范围为0.1%～1000%，固定频率为1 Hz.

力学性能测试：测试仪器为万能材料试验机；压缩性能样品规格为圆柱状，直径为 20 mm，高度为15 mm，压缩速度保持为5 mm/min，测试温度为室温；拉伸性能测试样品为哑铃型，长度为60 mm，宽度为5 mm，厚度为3 mm，拉伸速率为20 mm/min，测试温度为室温.

溶胀性能测试：采用质量分析法，将复合水凝胶样品自然风干后，称质量，记为W0；将复合水凝胶浸泡在去离子水溶液中，按照一定时间间隔称取水凝胶质量，记为Wd，直至溶胀平衡，溶胀率SR计算公式为

SR=(Wd-W0)/W0×100%

电导率测试：测试仪器为双电测四探针测试仪；样品规格为圆片，直径为20 mm，高度为3 mm；每个样品均重复3次，取平均值.

溶血性能测试：参考文献[17]，将一定量离心所得新鲜抗凝兔血红细胞加入37 ℃生理盐水中，再加入一定量所制备的复合水凝胶，恒温振荡60 min，利用紫外分光光度计测量其545 nm处的吸光度(OD).记ODa、ODb和ODc分别为实验组、阳性对照(没有浸泡复合水凝胶的去离子水兔血红细胞溶液)和阴性对照(没有浸泡复合水凝胶的生理盐水兔血红细胞溶液)的吸光度，溶血率HR计算公式为

细胞活性测试：委托公司为武汉赛维尔生物科技有限公司；采用甲基噻唑基四唑(MTT)法[18]，细胞活性CV计算公式为

其中，OD1为实验组的吸光度,OD2为对照组的吸光度.

2 结果与分析

2.1 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的制备机理分析

在低pH值(酸性)条件下，PMMS微球内部的羧基(—COOH)没有发生去质子化，微球仍以疏水性为主；随着pH值的升高(中性和弱碱性)，PMMS内部大量的—COOH发生去质子化，电离产生—COO-基团，微球从疏水性变为亲水性，发生吸水溶胀，内部相互挤压形成物理凝胶[19]；在更高的pH值(高碱性)条件下，PMMS乳胶粒的高分子链在—COO-的相互排斥作用下解缠结，形成带有—COO-基团的高分子链.利用PMMS具有经pH 诱导可从微粒到线状离子链的结构变化的性质，通过简单滴加NaOH溶液改变凝胶体系的pH值，制备出具有不同性能的CMCS-PMMS /PAAm复合水凝胶.PMMS乳胶粒的pH响应机理示意图见图1.

图1 PMMS乳胶粒的pH响应机理示意图Fig.1 The schematic diagram of pH responsiveness of PMMS emulsoid particles

2.2 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的结构分析

图2为不同pH值条件下制备的CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的SEM图与实例图.由图2a)可以看出，在pH值为6和7的条件下所制备的复合水凝胶孔洞结构内部仍有小孔存在，整个结构呈大孔套小孔的现象.随着pH值的不断增大，这一结构逐渐消失，形成骨架厚实的单一孔洞结构.这可能是因为在较低pH值条件下，PMMS仍为纳米级别的微球结构[5]，此时在网络中虽有交联，但由于微球结构的存在，CMCS-PMMS网络并不密集，主要以小片网络的形式穿插在PAAm网络中.而当pH值为9时，PMMS开始出现解缠结现象，成为聚合物长链，在EDC/NHS的作用下，与CMCS的交联更紧密，网络结构也更为规整，复合水凝胶孔洞的骨架也因此变得更加厚实.由图2b)可以看出，复合水凝胶的透明度随着pH值的增大而变大，这也从侧面验证了pH值对复合水凝胶结构的影响，以及PMMS在凝胶体系中发生了从微球到聚合物链的转变.

图2 不同pH值条件下制备的CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的SEM图与实例图Fig.2 SEM images and example diagrams of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogel prepared at different pH values

2.3 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶流变性能分析

图3为不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶流变性能的影响.由图3a)可以看出，储能模量G′整体呈先减小后增大的趋势，当pH值为6时，G′最大，为9200 Pa.这可能是由于CMCS-PMMS在EDC/NHS的作用下发生了交联反应，虽然PMMS发生了溶胀，但是微球之间没有相互挤压，仍留有空隙可以与CMCS进行交联.但当pH值与pKa(pKa=7.5[12])值相等时，PMMS发生充分的溶胀挤压，使其与CMCS的交联点减少，凝胶内部结构不连续，多为游离的CMCS高分子链，G′出现下降趋势.随着pH值继续增大，PMMS溶胀逐渐解开，体系中开始出现共聚物的高分子链，在EDC/NHS的作用下，高分子链部分与CMCS形成交联网络，G′有所升高.另外，由图3b)可以看出，在不同pH值条件下，复合水凝胶的损耗因子tanδ在临界应变前均小于0.1，这进一步表明复合水凝胶内部形成了有效的交联[20].

图3 不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶流变性能的影响Fig.3 The effect of pH value on rheological properties of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels

2.4 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶力学性能分析

图4为不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶力学性能的影响.由图4a)可以看出，当pH值为6和7时，复合水凝胶的抗压缩强度较大，但易发生屈服破裂；而当pH值为9和10时，复合水凝胶可以承受压缩应变至83%的变化而未出现屈服破裂的现象(此时的压缩变量为现用仪器的最大压缩量程).由图4b)可以看出，当pH值从6增至7时，复合水凝胶的断裂伸长率和最大拉伸强度都得到明显提升，这与压缩性能结果基本一致；当pH值继续增至9或10时，其拉伸强度有所降低，但断裂伸长率增至178%左右，这说明复合水凝胶的韧性随pH值的增大变得更好.这可能是因为当体系pH值为6和7时，复合水凝胶中PMMS部分仍为溶胀的微球，微球体积的增大造成微球之间相互挤压，提升了PMMS之间的物理交联点密度，虽然仍有游离的CMCS分子链存在，但是PMMS微球溶胀后的抗压缩强度在体系中起主导作用，因此复合水凝胶呈现刚而强的状态.这与先前研究报道[16]中，PMMS物理凝胶在pH值为6～7时机械强度最大的结果一致.随着pH值的继续增大，PMMS部分或全部解缠结变为舒展的高分子链，可以在凝胶体系中起到润滑的作用，从而增加复合水凝胶的柔韧性.

图4 不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶力学性能的影响Fig.4 The effect of pH value on the mechanical properties of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels

基于力学性能结果，选取pH=10条件下制备的CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶样品为模型，通过不间断的循环压缩评价抗疲劳性和形变恢复能力.图5为CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶(pH=10)的循环压缩曲线与耗散能变化趋势.由图5可以看出，复合水凝胶经历8次循环压缩至形变的80%后，除第1次循环外，其他循环压缩曲线图基本重合，滞后环基本一致，且在装卸循环过程中存在明显的滞后现象，这表明复合水凝胶可以有效耗散能量.尽管第1次循环压缩耗散能较大，为1037 kJ/m3，但随后第2次至第6次循环压缩耗散能均值降低至860 kJ/m3，第7次和第8次循环压缩的耗散能又有所升高，均值为900 kJ/m3.首次循环压缩耗散能较大可能是复合水凝胶内部有结构缺陷的网络发生了坍塌所致；在随后的循环压缩过程中，复合水凝胶的网络结构渐趋稳定，从而耗散能变化减小，逐渐趋于平衡；而随着循环压缩次数的继续增加，复合水凝胶内部游离的具有较大塑性形变能力的PMMS分子恢复形变的能力较弱，使耗散能又有所升高.

图5 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶(pH=10)的循环压缩曲线与耗散能变化趋势Fig.5 Cyclic compression and dissipative energy change of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels during cyclic comprising(pH=10)

2.5 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶导电性能分析

图6为不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶导电性能的影响.从图6a)可以看出，复合水凝胶的电导率随体系pH值的增大略有升高，最高可达2.98×10-4S/cm.这可能是因为复合水凝胶中羧基的电离程度随体系pH值的升高也有所提升，即羧酸根浓度升高，复合水凝胶内部形成较好的离子导电通路，进而使其电导率增加.由图6b)可以看出，将pH=10条件下制备的复合水凝胶作为导体连接在一个电压为3 V的闭合电路中，电路中的二极管可以发光，这进一步表明该复合水凝胶具有良好的导电性.

图6 不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶导电性能的影响Fig.6 The effect of pH value on the conductivity of composite CMCS-PMMS/PAAm hydrogel

2.6 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶溶胀性能分析

溶胀能力是指水凝胶吸收纯水、盐溶液或生理盐水的能力[21].图7为CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的溶胀性能曲线与溶胀前后抗压缩能力对比图.由图7a)可以看出，pH值分别为6，7，9条件下制备的复合水凝胶在水中的的平衡溶胀率(约为600%)及达到溶胀平衡所需的时间相差不大.但pH值为10时所制备的复合水凝胶的平衡溶胀率却高达860%.这可能是因为在碱性条件下复合水凝胶中未发生交联的带电离子基团(COO-)增加，尽管体系中氨基处于疏水状态，但由于电荷排斥和渗透作用，复合水凝胶的平衡溶胀率也会随之增大.

对于大多数吸水溶胀型的水凝胶，在达到平衡溶胀后，都会变脆，并失去弹性形变能力.但笔者发现，CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶即使在吸水达到溶胀平衡后，目测未见破损的痕迹，仍具有良好的压缩形变性能.由图7b)可以看出，复合水凝胶吸水后明显变大，用手尽力压缩溶胀后的凝胶，表面未见任何破裂之处，去除指压，复合水凝胶瞬即恢复至原来的形态.由此可知， CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶具有应用于水环境的潜能.

图7 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶的溶胀性能曲线与溶胀前后抗压缩能力对比图Fig.7 Property curves of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels and comparison of anti-compression capacity before and after swelling

2.7 CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶生物相容性分析

在生物医学和生物技术领域的应用中，考虑到合成高分子材料PAAm及小分子交联剂MBA与生物系统之间的相互作用[22]，对不同pH值条件下制备的CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶进行了溶血性能测试和细胞相容性研究，结果见图8.由图8可以看出，所有复合水凝胶样品的溶血率均小于5%，细胞活性均在75%以上.溶血性能测试往往被认为是评估材料血液相容性简单、可靠的方法.一般来说，溶血率应低于5%，且越低说明材料与血液的相容性越好[17].另外，根据文献[22]，当某种材料表面细胞活性大于75%时，可认为该材料具有良好的生物相容性.由以上结果可知，CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶具有良好的血液相容性和细胞相容性，有望作为生物材料应用于生物传感件、电子皮肤等领域.

图8 不同pH值对CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶生物相容性的影响Fig.8 The effect of pH value on the biocompatibility of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogel

3 结论

本文通过调节体系pH值和自由基聚合反应制备了一系列CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶，并考查了其流变性能、力学性能、导电性能、溶胀性能及生物相容性，得出如下结论：该复合水凝胶具有良好的流变性能、压缩性能和稳定的拉伸应变能力，即使经吸水溶胀后，仍具有良好的抗压缩性；具有良好的导电性和生物相容性，pH=10时电导率最高，可达2.98×10-4S/cm，所有复合水凝胶样品的溶血率均低于5%，细胞相对增殖率大于75%，均达到了国内相关标准对生物材料的要求[23].本文研究结果为CMCS-PMMS/PAAm复合水凝胶在溶液环境下的应用提供了可能，也使该类复合水凝胶有望应用于软骨修复、伤口敷料、生物传感器件、电子皮肤等生物医学领域.