临床用途细胞冻存保护液探索实验

姬广超，王晓明，王玉琪，宋航飞

近些年，我们国家的细胞产业发展迅速。不论是干细胞技术还是免疫细胞技术，相关的科学研究都十分火热，且有一部分机构的相关产品已经进入了临床试验阶段。不同于其他药品，细胞产品是具有代谢能力的活细胞，保存方法和保存时间受到了很大的限制，影响了其应用。

新鲜细胞产品保存时限较短，为了长期保存细胞产品，通常进行细胞冻存，保存在-80 ℃ 冰箱或是-196 ℃ 的液氮环境下。细胞冻存过程对细胞有伤害，所以需要细胞冻存保护液来减低细胞的损伤。实验室常用的细胞冻存保护液配方是 10% 二甲基亚砜（DMSO）+ 90% 胎牛血清（FBS），通用性好，细胞保护效果好，受到了广泛认可。但其配方中含有动物来源的 FBS，有无法消除的安全隐患。所以，用可临床应用的成分替代 FBS 具有重要意义。本实验采用可临床应用的成分替代 FBS，探索一种可供临床应用的细胞冻存保护液。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 细胞样本由上海安库生医生物科技有限公司细胞库提供。

1.1.2 仪器 HFsafe-1200LC 生物安全柜/HF90 二氧化碳培养箱为力康生物医疗科技控股有限公司产品；L535-1 低速离心机为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；Countstar IC-1000 细胞计数仪为上海睿钰生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 6% 羟乙基淀粉 130/0.4 氯化钠注射液购自费森尤斯；二甲基亚砜购自美国 Sigma 公司；人血白蛋白购自上海莱士血液制品股份有限公司；胎牛血清购自达科为生物技术股份有限公司；0.9% 氯化钠注射液购自安徽双鹤药业；葡萄糖购自碧云天生物；右旋糖酐购自上海泰坦科技股份有限公司；MSC FreezIS DMSO-Free 购自 Irvine Scientific 公司。

1.2 方法

本实验采用外周血单个核细胞（PBMC）和脐带间充质干细胞（UC-MSC）各 6 个样本进行实验。选取库存细胞样本，复苏后培养 24～48 h 后，收获计数。细胞定容至550～600 μl，取 100 μl 分别加入含 900 μl 不同细胞冻存保护液的 2 ml 冻存管中。放入程序降温盒移至-80 ℃ 冰箱，过夜转移至液氮罐保存。30 d 后，取出细胞，37 ℃ 水浴锅快速融化。混匀细胞并使用细胞计数仪进行台盼蓝法计数。统计计数结果：活细胞复苏率 = 冻存后活细胞数/冻存前活细胞数，使用统计软件 SPSS 26.0 进行单因素方差分析。不同冻存保护液配方见表1。

表1 不同冻存保护液配方

2 结果

2.1 PBMC 组不同配方冻存保护液活细胞复苏率

PBMC 组不同配方冻存保护液活细胞复苏率（表2）以配方 B 的冻存保护效果最好，差异显著（P＜ 0.05）。

表2 PBMC 组不同配方冻存保护液活细胞复苏率

2.2 UC-MSC 组不同配方冻存保护液活细胞复苏率

UC-MSC 组不同配方冻存保护液活细胞复苏率（表3）以配方 C 的冻存保护效果最好，差异极显著（P＜ 0.01）。

表3 UC-MSC 组不同配方冻存保护液活细胞复苏率

2.3 不分组不同配方冻存保护液活细胞复苏率

不分组不同配方冻存保护液活细胞复苏率（表4）以配方 C 的冻存保护效果最好，差异极显著（P＜ 0.01）。通过多重比较（表5），可见配方 B 的冻存保护效果虽然次于配方 C，但两者差异不显著。所以，配方 B 有望作为配方C 的替代方案，并有望成为一种可临床应用的冻存保护液方案。

表4 不分组不同配方冻存保护液活细胞复苏率

表5 不分组不同配方冻存保护液活细胞复苏率多重比较

3 讨论

细胞冻存保护液主要依靠其中的冷冻保护剂成分来实现在细胞冻存过程中保护细胞的作用。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜通常分为两大类型：渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂多为小分子中性物质，主要包括甘油、DMSO、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性保护剂多为大分子物质，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、白蛋白等[1]。

DMSO 是最常用的冻存保护剂和常用药用辅料，在国家药品监督管理局药品审评中心常用药用辅料数据库可以查询到其详细信息，但没有最大注射用量信息。美国 FDA官方网站，可以查询到的造血祖细胞、脐带血静脉注射用悬液的处方信息里提到，“二甲基亚砜的最大耐受剂量尚未确定，但静脉注射时一般不超过 1 g/(kg·d) 的剂量”。目前并没有药用注射级别的 DMSO 产品。

冻存液中加入 FBS，可补给细胞营养、增殖细胞因子、稳定培养液 pH 值及营造高浓度蛋白状态，对保护细胞有重要意义[2]。FBS 为异种血清，且其成分不明，不能用于临床。许多学者尝试用其他成分替代 FBS。游小燕等[3]用蔗糖、乙二醇、DMEM 替代 FBS 去冻存猪胎儿成纤维细胞；赵满仓等[4]用羟乙基淀粉、人血白蛋白和甘油替代 FBS 去冻存 DC 细胞，都取得了较好的效果。张丽娟等[5]采用其他临床可用成分（人血白蛋白、复方电解质注射液）来代替临床不可用成分（FBS 和细胞培养基），探索研究一种可供临床应用的细胞冻存保护剂，但并没有提供其冻存液与常用冻存液之间冻存效果的对比。

Park 等[6]通过实验证明了人血白蛋白（HSA）、人血清（HS）或敲除血清替代物（KSR）可以替代 FBS 用于人脂肪间充质干细胞的冷冻保存。Niknejad 等[7]使用人羊水来替代 FBS 冻存人羊膜上皮细胞，结果显示（含羊水的冻存保护液和含胎牛血清的冻存保护液）冻存细胞的存活率无显著差异。Ray 等[8]研制了一种无血清无毒性的 10% PVP/0.9%NaCl/60 mmol/L 依克多因的冻存保护液，用来冻存人脂肪来源的干细胞，存活率可高达 81%。Martina 等[9]使用丝胶蛋白替代冻存保护液中的 FBS 和 DMSO，实验结果显示，在冻存人骨髓间充质干细胞时，丝胶蛋白可以替代冻存保护液中的 FBS，却不能替代冻存保护液中的 DMSO。Yoshitake 等[10]使用超快速冷冻（superflash freezing，SFF）来实现细胞的无冻存保护剂的冻存方法，该方法已在小鼠成纤维细胞 3T3 细胞、小鼠成肌细胞 C2C12 细胞以及大鼠原代间充质干细胞等的冻存上获得了验证。该无冻存保护剂方法是否适合绝大多数细胞，还有待进一步验证。

本研究中使用的冻存保护液，不考虑实验室常用的配方C，配方 E 是采用的无 DMSO 的商品化冻存保护液，其他配方的成分中除 DMSO 外，皆有相应的临床药品提供。其中由于无法购买到右旋糖酐注射液，所以用氯化钠注射液、葡萄糖、右旋糖酐按照右旋糖酐注射液（右旋糖酐氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液）的比例配制替代临床药品成分来验证冻存液配方。本研究中，比较不同冻存保护液配方的冻存保护效果时，细胞冻存时间仅 30 天，检测指标也仅限于冻存细胞的活细胞复苏率，没有对复苏后细胞的增殖能力以及肿瘤杀伤活性等做进一步检测，存在一定的局限性。

从实验结果可以看出，冻存保护液的配方 B 和配方 C具有良好的细胞冻存保护效果。不分组统计分析时，配方 C的活细胞复苏率略高于配方 B，但两者差异不显著。研究的结果初步提示：在 DMSO 的临床风险可接受的情况下，冻存保护液配方 B 有望成为可供临床应用的冻存保护液，提高细胞产品的可用性和广泛性，能使更多的目标人群受益。

与实验室常用的冻存保护液成分及其配方相比，选用已获得国药准字的注射级药品作为冻存保护液成分（如配方B），在不显著降低冻存保护液对细胞保护效果的同时，还能够进一步提高冻存保护液自身在临床应用上的安全性；其产品成为某些种类的细胞治疗产品优选的冻存保护液，甚至有可能满足经深低温冷冻和保藏的细胞治疗产品在复苏后直接输入人体的要求，但其是否能最终成为可以直接输入人体的临床级细胞冻存保护液，尚有待进一步的相关研究和临床试验的证明。