UPLC法测定清达颗粒和清眩降压汤中黄芩苷的含量

林 珊，陈达鑫，蔡巧燕，张 铃，陈静雯，李金艳，彭 军，褚剑锋*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122；3.福建中医药大学陈可冀学术思想传承工作室，福建 福州350122；4.福建中医药大学药学院，福建 福州350122；5.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122）

清眩降压汤是陈可冀院士多年来用于治疗高血压的临床经验方，由天麻、钩藤、黄芩等十多味中药组成，用于肝阳上亢的高血压、缺血性脑血管病、眩晕等疾病［1-2］。清达颗粒由清眩降压汤化裁而来，具有清热泻火、平肝潜阳作用，保留原方中黄芩、天麻、钩藤，增加了具有清心、去热作用的莲子心［3］。前期研究发现，清眩降压汤和清达颗粒均能降低自发性高血压大鼠的血压和抑制心肾大血管损害［4-6］。而且2个复方均能促进血管舒张，且清达颗粒的舒张作用明显优于清眩降压汤［7］。为明确其中的主要药效成分以及确保临床疗效［8］，应建立清达颗粒的质量控制体系。本文通过超高效液相色谱法测定和比较清达颗粒和清眩降压汤中指标性成分黄芩苷的含量［9］，初步揭示2个复方控制血压的药效物质基础，为建立清达颗粒质量标准和临床实验研究提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AR2130电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；CP225D电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ-300DB台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 清达颗粒（批号20170309、20170329、20170405，江阴天江药业有限公司）；清眩降压汤颗粒（批号1701301、1701326、1701425，江阴天江药业有限公司）；黄芩苷（批号B20570，上海源叶生物科技有限公司），纯度大于98.0%；乙腈、甲醇（色谱纯，德国MERCK公司），其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称定黄芩苷对照品，加入适量甲醇，溶解成对照品储备液，其浓度为0.5 mg／mL。精密吸取适量储备液，加入甲醇稀释，摇匀，得黄芩苷对照品溶液0.05 mg／mL。

2.1.2 供试品溶液制备 称取清达颗粒0.1 g和清眩降压汤0.2 g，分别置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇10 mL，称重；超声提取20 min，放冷，再称重，用甲醇补重后，摇匀，取其上清液，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件的选择与优化

2.2.1 流动相选择 选择2组不同流动相系统：乙腈-水和乙腈-0.05%磷酸。取清达颗粒供试品溶液，分别以2种流动相梯度洗脱。结果表明，当乙腈-水为流动相时，黄芩苷的出峰时间为5.73 min，色谱峰的分离效果不好，分离度小，杂质峰多，峰型不理想。采用乙腈-0.05%磷酸时，黄芩苷的出峰时间7.10 min，分离度达到要求，未有杂峰。故选用乙腈-0.05%磷酸。

2.2.2 检测波长选择 选择3个不同的检测波长220、280和300 nm。280 nm下所得色谱图的色谱峰分离度较好，杂峰较少。黄芩苷色谱峰紫外吸收较大，响应值高，基线较平稳，故选用280 nm作为检测波长。

2.2.3 色谱条件 色谱柱Acclaim UPLC RSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2μm）；流动相乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱，梯度程序：0～20 min，2%～80%乙腈；流速0.4 mL／min；柱温30℃；检测波长280 nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 参照前期研究结果［9］，取黄芩苷对照品溶液，分别配制0.01、0.02、0.03、0.05、0.07 和0.10 mg／mL进样，记录黄芩苷色谱峰的峰面积。标准曲线回归方程为y＝11 736x＋33.196（r2＝0.999），说明黄芩苷标准品在0.01～0.1 mg／mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 取黄芩苷对照品溶液（0.05 mg／mL），进样量2μL，连续进样6次，记录色谱峰峰面积，计算黄芩苷的RSD。结果表明，黄芩苷RSD为0.39%，说明本实验所建立方法的精密度良好。

2.3.3 重复性试验 分别取清达颗粒（批号201703 09）6份和清眩降压汤（批号1701301）6份，按上述供试品溶液方法制备，进样量2μL，记录色谱峰峰面积。实验结果所得黄芩苷峰面积RSD分别为2.50%和2.89%，表明该实验方法重复性好。

2.3.4 稳定性试验 分别取清达颗粒（批号201703 09）和清眩降压汤（批号1701301），按上述供试品溶液方法制备，在0、2、4、6、12和24 h分别进样2μL，记录色谱峰峰面积。实验结果所得黄芩苷RSD分别为0.69%和0.66%，说明方法的稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 分别取0.1 g清达颗粒和0.2 g清眩降压汤样品各9份，按照一定比例（样品中含有的黄芩苷∶黄芩苷对照品＝1∶0.5、1∶1、1∶2），加入一定量的黄芩苷对照品溶液制备成供试液，每种比例各制备3份。2μL进样，记录色谱峰的峰面积，计算回收率。黄芩苷在清达颗粒中的回收率为94.78%，RSD为2.58%，黄芩苷在清眩降压汤中的回收率为94.56%，RSD为2.16%，说明该样品回收率良好，结果见表1和表2。

表1 清达颗粒中含有的黄芩苷的回收率试验

表2 清眩降压汤中含有的黄芩苷的回收率试验

2.3.6 供试品溶液的测定 取清达颗粒（批号20170309、20170329、20170405）和清眩降压汤（批号1701301、1701326、1701425）各3批次，分别按照上述方法制备供试品溶液，进样量2μL，记录色谱峰的峰面积。结果黄芩苷含量分别为4.35 mg／g和0.83 mg／g，RSD分别为1.30%和2.06%。结果见表3、表4和图1。

表3 清达颗粒的黄芩苷含量测定

表4 清眩降压汤的黄芩苷含量测定

注：A黄芩苷对照品；B清达颗粒；C清眩降压汤；1黄芩苷。

3 讨 论

在前期研究，我们发现黄芩苷作为清眩降压汤主要成分之一［9］，其含量较大，色谱峰分离度好，因此选用黄芩苷作为清达颗粒和清眩降压汤的指标性成分。文献报道黄芩苷具有抗高血压的作用［10-11］，2个复方也都具有抗高血压的药效作用，并且清达颗粒的药效要优于清眩降压汤。本研究结果可见，清达颗粒中黄芩苷的含量明显高于清眩降压汤，因此黄芩苷应是清达颗粒和清眩降压汤抗高血压药效物质基础之一。

根据文献报道，已采用超高效液相色谱法对复方和黄芩药材中黄芩苷进行含量分析［12-13］。在色谱条件摸索过程中，对流动相、检测波长等参数进行比较，确立最佳色谱条件，在一定时间内2个复方中黄芩苷实现良好的分离。以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，黄芩苷分离度较差，因此采用乙腈-0.05%磷酸进行梯度洗脱，结果黄芩苷色谱峰得到了很好的分离，目标峰突出，周围杂峰相对较少，有利于复方中黄芩苷的检测。

本研究方法准确性和重现性好、便于操作，可用于测定清眩降压汤和清达颗粒中主要成分黄芩苷的含量。建立以黄芩苷为指标性成分的清达颗粒质量标准，完善清达颗粒的质控体系，为清达颗粒创新中药的研发提供实验数据。