补骨脂素对HTB-47和CRL-1932肾癌细胞系的增殖、侵袭和迁移的影响及相关机制

袁令兴 李秀峰 顾传兰 卢世军 娄庆艳 刘源 林繁录 徐英民

临沂市中心医院泌尿外科276400

0 引 言

肾癌在全球男性中的发病率位于第6 位，在全球女性中的发病率居于第8 位[1]，且在我国的发病率呈现一个逐年递增的趋势[2]。肾癌的死亡率位居全球前十位，是一类严重的恶性肿瘤疾病[3]。近年来，针对天然药物中的抗癌活性成分在肿瘤治疗中的研究越来越多，很多疗效甚佳的天然药物被发掘出来。补骨脂素为传统中药补骨脂的主要化学成分[4]，对众多肿瘤细胞具有显著的抑制作用，有望成为一种疗效显著的抗癌药物[5-7]。然而，补骨脂素对肾癌细胞的影响尚不明确。本研究中，利用体外培养的肾癌细胞系HTB-47 和CRL-1932，观察补骨脂素对肾癌细胞增殖、侵袭能力的影响，探索细胞培养前期的最合适的补骨脂素浓度。此外，分析补骨脂素对细胞增殖抗原（marker of proliferation Ki-67，MKI67）和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达的影响，研究其抑制增殖的机制；分析补骨脂素对基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase,MMP2）和MMP9 表达的影响，研究其抑制迁移、侵袭的内在机制。本研究结果可为进一步寻找肾癌新的治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

HTB-47 与CRL-1932 肾癌细胞系（美国ATCC 细胞公司），Ki67/MKI67 抗体（ab156872）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体（ab8245）、PCNA 抗体（ab29）、MMP2抗体（ab92536）、MMP9 抗体（ab76003）、β-acting 蛋白（英国Abcam 公司），补骨脂素（西亚化学科技有限公司），RPMI1640 培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司）。

CO2恒温培养箱、Transwell 小室、细胞培养板、细胞培养瓶（美国Thermo Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及加药处理

将5 mg 补骨脂素粉末溶于300 μl 二甲基亚砜中制成储存液，保存在-80 ℃环境中。实验时根据需要用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀释到指定浓度。

HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞系置于含体积分数为10%胎牛血清和1%青-链双抗的RPMI1640培养液的培养瓶中，放入5%CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养。待细胞长满培养瓶后，用胰酶消化，然后将细胞离心吹打均匀铺在6 孔板中。待6 孔板中的细胞密度达50%～70%时，对照组中加入二甲基亚砜，实验组中加入含补骨脂素为30 μg/ml 的二甲基亚砜溶液。加药后继续在细胞培养箱中培养24 h。

1.2.2 蛋白印迹法（Western blot）检测蛋白表达

HTB-47 和CRL-1932 细胞加补骨脂素处理24 h后，裂解细胞并萃取总蛋白。在测定蛋白浓度后，计算定量，然后用95 ℃变性处理5 min。进行Western blot 检测，根据步骤转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，之后将膜封闭，用1∶1000配 置 好 的MKI67、PCNA、MMP2、MMP9 和GAPDH一抗（1∶1000 稀释）在4 ℃摇床孵育过夜。次日，二抗室温孵育1 h），用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法进行曝光。最后，用Image J 图像处理软件进行灰度分析。

1.2.3 划痕实验

在铺满生长HTB-47 和CRL-1932 细胞的培养板上用10 μL 移液枪的枪头进行细胞划线，换新配制的含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，在显微镜下拍照保存。然后加入补骨脂素，24 h 后，从细胞培养箱取出细胞培养板，换液后再次拍照。利用Image J 图像处理软件计算各组细胞的迁移距离，每组至少重复3 次。

1.2.4 细胞侵袭实验

在加入补骨脂素24 h 后，将实验组和对照组细胞以每室200 μL 细胞悬液（2×104/室） 接种于Transwell 小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基。将Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育48 h 后取出。PBS 冲洗2 遍后，用4%多聚甲醛固定25 min，再次清洗后，用质量分数为0.1%的结晶紫在4 ℃染色30 min，染色结束后清洗晾干。在100 倍显微镜视野下，取4～5个视野进行拍照计数，每组至少重复3 次。

1.2.5 增殖克隆形成实验

在对照组和实验组细胞进行胰酶消化并计数后，以每孔2000 个细胞的密度接种于6 孔板中，然后放于细胞培养箱继续培养。培养5～7 天后，取出6孔板，用PBS 冲洗2 次，每次3 min。然后，每孔加入1 ml 质量浓度为40 g/L 的多聚甲醛溶液，置于4 ℃固定30 min，再次用PBS 冲洗2 次，用配制好的结晶紫工作液在4 ℃条件下染色30 min。染色结束后，取出6 孔板，再次用PBS 清洗，风干。用Image J 图像处理软件统计计数，每组重复不少于3 次。

1.3 统计学方法

采用GraphPad 7.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，两组间比较采用t 检验，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 细胞增殖能力的影响

细胞增殖实验结果显示，相对于二甲基亚砜处理的对照组，补骨脂素处理的HTB-47 和CRL-1932细胞的克隆形成能力明显受到抑制（图1A）。该结果说明补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 细胞的增殖能力有影响。为了进一步说明补骨脂素的抑制作用，用细胞计数试剂盒（cell counting kit 8，CCK8）进行了细胞计数实验。结果显示，相比于对照组，实验组中HTB-47 和CRL-1932 细胞的增殖明显受到抑制（图1B）。上述结果证实补骨脂素对于肾癌细胞的增殖有抑制作用。

图1 补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞增殖的抑制作用

2.2 Western blot 结果

使用Western blot 法检测HTB-47 和CRL-1932细胞增殖相关蛋白（MKI67、PCNA）的表达情况。MKI67 是一种核抗原，是细胞增殖的标记物，其指数高低与许多肿瘤的分化程度、浸润、转移及预后密切相关；PCNA 是增殖细胞核抗原，仅存在于正常增殖细胞和肿瘤细胞中，在细胞增殖的启动方面起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。Western blot 结果显示，相比于对照组，实验组HTB-47 和CRL-1932 细胞的MKI67 蛋白表达明显受到抑制（图2A），PCNA 的蛋白表达也明显下调（图2B）。该结果提示，补骨脂素可能是通过降低MKI67 和PCNA的表达从而抑制HTB-47 和CRL-1932 细胞的增殖。

图2 补骨脂素对肾癌细胞中MKI67 和PCNA 的影响

2.3 补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 细胞侵袭和迁移能力的影响

Transwell 细胞迁移实验结果显示，与对照组相比，实验组，即补骨脂素处理后的HTB-47 和CRL-1932 细胞的侵袭能力明显受到抑制（图3A）。说明补骨脂素可明显抑制HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞的侵袭能力。为了进一步验证此结论，又进行了划痕实验，其结果显示，实验组肾癌细胞的迁移距离明显小于对照组细胞（图3B）。该结果进一步说明补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 细胞的侵袭、迁移能力有抑制作用。上述结果提示，补骨脂素可能作为肾癌治疗的一种潜在有效的治疗药物，有助于提高患者的治愈率和生存率。

图3 补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞侵袭和迁移的抑制作用

2.4 补骨脂素对肾癌细胞中MMP 蛋白的影响

MMP2 和MMP9 是MMP 基因家族的成员，二者主要功能在于降解细胞外基质蛋白并参与信号转导，其高水平表达常与肿瘤的侵袭和迁移相关联。因此，测定对照组和实验组肾癌细胞中MMP2 和MMP9 的表达水平，以此分析补骨脂素对肾癌细胞侵袭、迁移能力的影响机制。结果显示，实验组，即补骨脂素处理的HTB-47 和CRL-1932 细胞中的MMP2和MMP9 蛋白水平明显低于对照组（图4）。该结果提示，补骨脂素可能通过下调MMP2 和MMP9 的蛋白表达水平，从而抑制HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞的侵袭、迁移能力。

图4 补骨脂素对肾癌细胞中MMP2 和MMP9 蛋白表达水平的影响

3 讨 论

肾癌高居不下的发病率和死亡率是其诊治过程中的最大难题[8]。近年来，尽管肾癌的治疗技术已经得到了显著的进展，手术切除、新辅助放化疗、内分泌治疗、免疫治疗、靶向治疗、中医药治疗等多种治疗方式的联合，使肾癌患者的5年生存率得到了极大提高，预后也明显得到改善[9-10]。但每年因肾癌死亡的患者数量仍然很大，改进或创新肾癌的治疗方案仍然是急需解决的问题[11]。

补骨脂素是传统中药补骨脂种子中的主要有效成分，属于呋喃豆素类化合物[12]。大量研究结果表明，补骨脂素具有广泛的药理作用和生物活性，涉及保护心血管、抗组胺作用、促进粒细胞的生长、抗生育雌激素样等多方面作用[13-14]。近年来，补骨脂素的抗肿瘤作用得到广泛研究，其在肿瘤治疗中的作用也逐渐被重视。大量学者通过体内外研究发现，补骨脂素对多种肿瘤细胞系及实体肿瘤有明显的抑制作用，包括乳腺癌[5]、白血病、肝癌[6]、肺癌[15]、前列腺癌、黏液表皮样癌等。然而，补骨脂素在肾癌中的作用效果还尚不明晰，缺少详细的研究来分析补骨脂素对肾癌细胞的具体影响。本研究旨在初步研究补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞系的影响，并探讨其内在影响机制。

本研究结果显示，补骨脂素处理之后的HTB-47和CRL-1932 肾癌细胞的增殖克隆能力明显减弱，肾癌细胞的增殖能力被显著抑制。为了解释这一抑制现象，检测了对照组和实验组肾癌细胞中的重要增殖指标，即MKI67 和PCNA 的蛋白表达量。结果显示，补骨脂素处理的HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞中，MKI67 和PCNA 的表达明显下调。这可能是补骨脂素抑制肾癌细胞增殖的内在机制。此外，Transwell 和划痕实验结果显示，补骨脂素处理的HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞的侵袭、迁移能力也明显受到抑制。因此，通过免疫印迹法测定了对照组和实验组中MMP2 和MMP9 的蛋白表达量，以探究补骨脂素对HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞侵袭、迁移能力的影响机制。结果显示，补骨脂素处理的HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞中的MMP2 和MMP9 表达量显著下调。该结果提示，补骨脂素可能是通过介导MMP2 和MMP9 来抑制肾癌细胞的侵袭和迁移。但本研究中仅初步探讨了补骨脂素抑制肾癌进展的内在机制，具体的内在作用和详细机制有待于进一步研究。

4 结 论

传统中药成分补骨脂素可显著抑制HTB-47 和CRL-1932 肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，其机制可能涉及下调MKI67、PCNA、MMP2 和MMP9 的蛋白表达。补骨脂素有望作为一个治疗肾癌的潜在而有效的药物。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突