MCM6在膀胱癌中的表达及其与预后相关性研究

胡铁良 庞亮

天津市职业病防治院，天津市工人医院泌尿外科300011

0 引 言

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率与死亡率，每年约有400 万新发病例[1-2]。膀胱癌的病理类型有膀胱尿路上皮癌、鳞状细胞癌和膀胱腺癌，其中以膀胱尿路上皮癌最常见，约占膀胱癌总数的90%[3]。膀胱癌的治疗主要包括手术切除、放疗、化疗及综合治疗等[4]。膀胱癌缺乏显著的早期症状，因此患者往往在就诊时已处于进展期[5]。因此，准确而敏感的膀胱癌早期诊断方法具有重要意义。当前，膀胱癌检测仍以尿细胞学检查为金标准，而当前已有多种尿液标记物得到确认[6]。对膀胱癌的发病机制进行研究有助于找到新的更敏感的标记物[7]。同时，由于晚期膀胱癌的高转移性，研究新的膀胱癌标记物及治疗手段仍是当务之急[6]。近年来，膀胱癌的靶向治疗已显示出良好前景，但为了提高膀胱癌患者的生存率，寻找新的预后预测因子及治疗靶点仍然重要。

微小染色体维持蛋白（minchromosome maintenance proteins, MCM）是一类于20 世纪80年代通过生化手段从酵母中分离得到的蛋白。MCM 主要存在于细胞核中，负责染色体功能维持、DNA 复制及细胞分裂[8-9]。目前，研究者已发现6 个MCM 家族蛋白，包括MCM2～MCM7[10]。由于MCM 蛋白在静止、衰老和分化的细胞中均表达下调，因此可以作为标记物来识别有增殖能力的细胞[11]。这意味着MCM2～MCM7可以在细胞癌变之前被识别，从而进行早期诊断和治疗[12]。MCM6 是MCM 蛋白家族的一个重要成员，参与细胞周期调控，并影响细胞增殖、迁移等多个细胞过程[13]。MCM6 广泛影响肿瘤的发生发展，在多种肿瘤（如肝癌、乳腺癌、胃癌等）中具有重要的调控作用[14-16]。在子宫内膜腺癌中，MCM6 的表达与组织学分级和生存率相关[17]。MCM6 通过MEK/ERK通路促进肝细胞癌转移，并可作为识别肝细胞癌早期复发的血清生物标志物[15]。MCM6 的过表达与胶质瘤患者的生存率密切相关[18]。尽管MCM6 对肿瘤的影响已有广泛报道，其在膀胱癌中的表达及对膀胱癌的潜在影响仍不明确。

本研究中，旨在探讨MCM6 在膀胱癌组织及相应正常组织中的相对表达及其与临床预后的关系，有助于更好地认识MCM6 在膀胱癌发展中的作用机制，从而对研究监测及治疗膀胱癌的新方法有十分重要的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2016年8月至2019年9月，天津市工人医院泌尿外科收治的经手术治疗的膀胱癌患者83例。其中，男性45例，女性38例，年龄59.2 岁±16.9 岁。全部病例均经过病理证实，术前未经化疗或放疗，且具有完整的病例资料。收集患者的一般临床资料，包括年龄、性别、肿瘤分期和肿瘤分化特征等。83例病例中，肿瘤分期T1～T2 期者39例，T3～T4 期者44例；肿瘤分化低级别者31例，高级别者52例。

1.2 主要材料与仪器

MCM6 兔抗人单克隆抗体（ab201683，英国Abcam 公司），PV-6001 免疫组化检测试剂盒、ZLI-9018 二氨联苯胺（diamio benzidine，DAB）显色试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司）。

RM2235 型石蜡切片机（德国Leica 公司），BX51型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.3 免疫组织化学检测方法

膀胱癌肿瘤及癌旁组织通过福尔马林固定及石蜡包埋。包埋后的蜡块标本进行5 μm 切片，进一步进行MCM6 免疫组化染色。切片于75 ℃孵育30 min，随后用二甲苯脱蜡，并通过梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，80%，75%）进行水合。水合完毕后，使用柠檬酸缓冲液孵育25 min 修复抗原，并阻断内源性过氧化物酶5 min，使反应充分进行。随后用质量浓度为50 g/L 的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭液封闭30 min。封闭后使用MCM6 抗体孵育2 h，抗体采用1∶200 稀释。然后，切片用生物素化的二抗孵育1.5 h，使用DAB 法显色，苏木素复染细胞核。免疫组化切片于显微镜下观察拍照采集图像，根据肿瘤细胞阳性染色面积和染色强度综合评价免疫组化结果。

通过染色证实，MCM6 蛋白在肿瘤组织中呈核定位。随机选取5 个不同的视野，依照阳性细胞在总细胞数中的比例进行评定。阳性细胞比例评分标准：肿瘤细胞阳性百分数<10%时，记0分；10%～40%时，记1分；40%～70%时，记2分；>70%时，记3分。阳性染色强度评分标准：阴性染色记0分；弱阳性染色记1分；中阳性染色记2分；强阳性染色记3分。以阳性细胞百分比评分和染色强度评分的和判断表达情况，总分范围为0～6分。总分为0～2分为MCM6 低表达，3～6分为MCM6 高表达。

1.4 统计学方法

采用Graphpad 6.0 统计学软件处理数据。通过基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA） 数据库分析MCM6 的mRNA 在膀胱癌组织中的水平。通过ProteinAtlas 数据库（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000104738-MCM6/tissue）分析不同肿瘤组织中MCM6 的表达与患者预后的相关性，并通过GEPIA 数据库比较MCM6不同表达组膀胱癌患者的总生存及无病生存率差异（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=MCM6）。符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（Mean±SD）表示，通过卡方检验比较临床病理特征与患者膀胱癌和正常癌旁组织中MCM6 表达之间的相关性，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MCM6 在常见肿瘤中的表达

为探究MCM6 对膀胱癌的作用，首先通过ProteinAtlas 数据库分析MCM6 在不同肿瘤中的表达水平。结果表明，MCM6 蛋白在多种肿瘤组织中高表达，如结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌（图1A）。进一步通过生物信息学分析方法发现MCM6 在多种肿瘤组织中呈现高表达，如结直肠癌、头颈癌、甲状腺癌等（图1B）。

图1 ProteinAtlas 数据库分析微小染色体维持蛋白6（MCM6）在不同肿瘤组织中的表达水平

2.2 生物信息学分析结果

通过GPEIA分析MCM6 的mRNA 在膀胱癌组织和正常组织中的表达情况，共分析膀胱癌组织404例及正常组织28例。结果表明，MCM6 的mRNA 在膀胱癌组织中显著高表达（P<0.05），如图2 所示。

图2 膀胱癌中微小染色体维持蛋白6（MCM6）的mRNA 表达

为了进一步证明MCM6 在膀胱癌进展演变中发挥的作用，利用Kaplan-Meier分析MCM6 与膀胱癌患者预后之间的关系。结果表明，MCM6 表达水平与患者的总生存率（P=0.036）和无病生存率（P=0.01）均具有相关性（图3A 和图3B）。上述结果提示，MCM6 的表达水平与患者预后密切相关。

2.3 MCM6 在膀胱癌组织中的表达

为了探究MCM6 在膀胱癌的进展中的角色。本研究中，运用免疫组织化学染色方法检测83例膀胱癌组织中的MCM6 的表达情况。结果显示，MCM6主要定位于细胞核，其表达量在膀胱癌组织中明显高于癌旁正常组织（图4A）。根据染色的强度，将膀胱癌患者分为MCM6 高表达组和MCM6 低表达组。分组后发现，MCM6 在癌旁正常组织中的表达量显著降低（图4B）。

2.4 MCM6 蛋白表达水平与膀胱癌患者的临床病理特征的相关性

为了进一步明确MCM6 对膀胱癌的临床意义，分析比较了MCM6 高表达组和MCM6 低表达组患者的临床病理特征差异，包括年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级。结果表明，MCM6 的表达水平与膀胱癌患者的肿瘤分期相关（P=0.025），而与年龄（P=0.872）、性别（P=0.903）、肿瘤分级（P=0.923）无关（表1）。

图3 微小染色体维持蛋白6（MCM6）表达与膀胱癌患者生存率的相关性

图4 膀胱癌组织和癌旁正常组织中微小染色体维持蛋白6（MCM6）的免疫组化结果

表1 微小染色体维持蛋白6（MCM6）蛋白表达与膀胱癌患者临床病理特征的相关性分析

3 讨论与结论

近年来，膀胱癌的发病率及死亡率居高不下，主要因为膀胱癌缺乏显著的早期症状，进展迅速，且缺乏有效的治疗方法。早期诊断和靶向治疗是提高膀胱癌生存和改善其预后的关键手段，膀胱癌的早期诊断能显著提高膀胱癌患者的生存率[2]。但早期诊断需要高效灵敏的生物标记物，并需要结合影像学、尿细胞学手段进行综合判断[7]。近年来，虽然研究者发现了一些膀胱癌早期诊断生物标记物，其中部分已用于临床诊断，但其灵敏度及特异性仍有待提高[5]。本研究结果显示，MCM6 在膀胱癌组织中显著高表达，并提示不良预后。进一步研究发现，MCM6 与患者的临床病理特征相关。上述结果提示MCM6 可作为潜在的膀胱癌生物标记物。

在本研究中，通过检测GEPIA 数据库，发现膀胱癌组织中的MCM6 的mRNA 表达水平显著高于正常膀胱组织，且MCM6 的mRNA 水平与膀胱癌患者的总生存率及无病生存率显著相关，提示MCM6可作为膀胱癌的预后预测因子。免疫组化结果也显示膀胱癌组织样本中，MCM6 蛋白呈显著高表达。通过进一步对免疫组化的染色结果进行评分分组，并在分组后分析不同MCM6 表达水平患者的临床病理特征，发现MCM6 与膀胱癌的肿瘤分期密切相关。肿瘤分期是肿瘤恶性程度的一个重要指标，这提示MCM6 在膀胱癌的进展中可能具有重要的调控作用。在膀胱癌患者中，细胞增殖、细胞迁移的失控会显著促进膀胱癌的进展[19]。本研究中，MCM6 影响膀胱癌患者的肿瘤分期，暗示MCM6 可能会对膀胱细胞增殖、迁移及侵袭有影响。这需要开展一系列体外实验，以揭示MCM6 对膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭等过程的影响，为膀胱癌的靶向治疗提供新的线索。

MCM6 对于多种肿瘤具有广泛的影响，包括乳腺癌、胃癌、肝癌等[14-16]。MCM6 在这些肿瘤中通过不同的调控方式影响肿瘤的进展。在肝细胞癌中，MCM6 主要通过调控细胞周期而影响肝细胞癌的进展[20]。研究结果表明，MCM6 能够参与非小细胞肺癌的进展并提示不良预后，但其作用机制有待进一步研究[21]。在脑膜瘤中，MCM6 蛋白的表达与组织学分级和临床结果密切相关[22]。本研究结果也证实，MCM6在膀胱癌组织中异常高表达，并与患者预后和临床病理特征相关。但是，MCM6 通过何种方式调控肿瘤的进展，仍然值得进一步研究。

根据文献报道，MCM6 主要定位于细胞核[13]，这与本研究的免疫组化染色结果相一致。MCM6 在细胞核中的主要功能是维持MCM 复合体的稳定，并进一步保证DNA 复制及细胞分裂的正常进行[13]。因此，MCM6 的异常表达会导致细胞周期及增殖的异常，因此会导致肿瘤的进展与转移[20]。MCM6 与患者的临床病理特征有关，可能是由于其核定位影响了相关细胞功能。除了MCM6 之外，MCM 家族其他的蛋白成员均在不同肿瘤组织中存在异常表达的情况，而这些蛋白在其他肿瘤组织中也能够反映患者预后，有些则参与肿瘤的进展与转移[9]。例如，MCM2对于乳腺癌的预后有明显的提示作用[23]，而MCM3在结直肠癌中高表达，并能够调控肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭[24]。上述研究结果和本研究的结果，进一步证实MCM 家族蛋白可作为肿瘤的预后预测因子。

综上，膀胱癌是一种普遍的且具有高转移性的肿瘤，MCM6 在膀胱癌组织中显著高表达，并与患者的肿瘤分期显著相关，此外MCM6 的表达与膀胱癌患者预后显著相关，提示MCM6 可作为膀胱癌潜在的预后预测因子。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突